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分子生物学技术在检验医学中的应用

朱忠勇

来源：检验医学专题网    摘自江西医学检验    加入日期

特别是前几年，PCR技术在我国“遍地开花”，许多同行初步了解了一些有关DNA 的结构、碱基的配对互补、变性(解双链)、退火复性(恢复双链)等分子生物学知识，为我国医学检验界广泛开展分子生物学技术打下了一定基础。因此本文不拟从基本原理到技术作系统介绍，只讲与医学检验有关的技术与新近的进展。不过为了使从未接触过这方面内容的同志能理解，在正式介绍之前，先对一些常用的术语和概念，按现代的观点作一简要介绍。

1 常用的术语和概念

1.1 生物大分子:指生物体内分子量在500kD以上的有机分子，主要是核酸、蛋白质(及多糖)，是分子生物学主要的研究对象。核酸的基本单元是核昔酸，许多核昔酸通过磷酸二醋键相互联接;蛋白质的基本单元是氨基酸，它们通过肤键相互联接，大量基本单元连接成的直线继而又卷成螺旋状或折叠(如DNA的双链螺旋，蛋白质a螺旋和p折叠)。这种螺旋再进一步盘绕(或超螺旋化)、堆积，因而构成所谓一级、二级、三级以至四级结构等特殊的构象。这是从事分子生物学的工作者认识大分子物质时必备的基本概念。

1.2 构型(configuration)和构象(conformation);这是两个经常被误用的术语。构型是指有关原子在分子中光学不对称的立体结构，如氨基酸的D型、L型等，它们可被分离;只有共价键发生变化时才能改变它(如D型变为L型)。而构象是不需要共价键改变就能使立体结构发生变化的一种结构，如蛋白质、核酸的三级结构。目前有不少同志将本该叫构象的称作构型是不对的。

1.3 原核生物与真核生物:从分子生物学观点简单地说，原核生物(如细菌、立克次氏体)的DNA散在胞质中而没有核，其基因中没有内含子;真核生物(如植物、真菌、动物)DNA多集中在核内，基因构成较复杂，除含有外显子外还含有内含子，且DNA中只有不到1%是蛋白质合成所需的，其余都是些“结构”成分，大部分功能不明。真核生物的基因组DNA转录产生的初级产物hnRNA，要将夹在其中非编码的内含子剪除，仅留下外显子部分互相连接成为成熟的mRNA，才能翻译成蛋白质。在此顺便 提一下，在分子生物学实验中经常用到的一个词一cDNA, CDNA是与RNA互补的DNA, 是从成熟的mRNA分子“拷贝”下来的。它不含内含子，可在细菌、酵母等细胞内表达(翻译成蛋白质)，通常通过逆转录酶以mRNA为模板合成。

1.4 克隆(clone):原意是“无性繁殖系”(例如通过一种植物细胞培养出一株植物)，但目前多被滥用、乱用。严格地讲，克隆必须符合以下几点:(1)必须是无性繁殖，(2)祖代及各子代成员的结构完全相同，(3)是指一个群体。由此来看，“多利”羊也不能称为克隆。(事实上其发明者Wilmut本人也从未称其为克隆，而称“重建胚”(reconstructed embryos)因为它们是通过两只羊的不同细胞通过融合制成的，融合细胞实际上含有一只羊的细胞核和另一只羊的细胞质，后者含有诸多细胞器，其中线粒体还含DNA! 这不符合克隆的原始定义。分子生物学上的基因工程也称分子克隆。

1.5 基因(gene)和基因的表达(expression):根据现代的分子生物学知识，要给基因下一个既简单又通俗的定义是比较困难的。比较科学的说法是: 基因是一个遗传功能单位，是合成有功能的蛋白质多肤链或RNA所必需的全部核昔酸序列(主要是DNA，在某些病毒则是RNA)。按照这一定义，一个基因不仅包括编码蛋白质肤链或RNA的核昔酸序列，还包括保证转录所必需的，处于上游的调控序列，5'端的其他非翻译序列、内含子以及3'端的非翻译序列等。基因的表 达是指从DNA-RNA-蛋白质合成的全过程。所有的体细胞都含有同样的基因，但在细胞分化过程中，往往有些基因表达，有些关闭，或仅在胚胎期或病理情况下表达。但按理说，不仅是干细胞，就是体细胞都具有表达所有功能性蛋白质成分的潜能，这就是用体细胞“克隆”动、植物，用干细胞移植治疗恶性病，或从培养干细胞着手，按照定向诱导分化的原理，“人工制造”组织和器官以及检测某些胚胎蛋白或癌基因表达的蛋白质用于疾病诊断的依据。

1.6 分子生物学中的常用的工具酶

(1) 限制性核酸内切酶:是最常用的工具酶，目前商品化产品已多达数百种，多从细菌体内提取所得。它能识别双链DNA中特定的核昔酸序列，水解切断链中的磷酸二醋键，将DNA链切成所需的片段，以便进行基因分析、克隆、重组等。

(2) D N A 聚合酶:是一种催化脱氧核昔酸合成DNA链的酶，它通常以一条核酸链为模板，按照碱基配对互补的原则，从5’端-3‘端将核昔酸依次添加到链上。DNA聚合酶也有好多种，在PCR试验中用到的耐热的Taq-DNA聚合酶是常用的一种。

(3) 逆转录酶:是逆转录病毒体内发现的一种以RNA为模板的DNA聚合酶，是合成cDNA所必需的工具酶。此外还有 DNA连接酶,RNA聚合酶、末端脱氧核昔酞转移酶等。

1.7 分子杂交和探针:天然的两条互补的DNA和RNA链，可与人工制备的含有特殊标记的互补的DNA或RNA配对结合，称为杂交;此类标记的核酸就称为探针。标记物有放射性同位素，荧光物质、酶、生物素、地高辛等等。

1.8 质粒(plasmid)和载体(vector):质粒是一种细菌体内能独立复制的染色体外的遗传因子，大部分是环状DNA，可由宿主菌丢失并可在宿主之间相互传播。它含有一些基因，如抗生素抗性基因等，并有一个至多个限制酶切点;质粒或噬菌体DNA中，可插入外源DNA片段构建成载体。载体可在宿主体内自主复制，从而使克隆的DNA片段得到增殖。带有表达系统的载体，并可进行表达，是分子生物学实验和基因工程中最重要的工具之一。

1.9 重组(recombination):在分子生物学上的意思是:在体外使特定的DNA片段与质粒DNA连接成一杂种分子，进而引人宿主得到克隆和扩增。这是基因工程的主要步骤。因此，现在往往将基因工程产品称为重组品。例如，rhEPO代表重组的人促红细胞生成素。

2 医学检验中常用的分子生物学技术分子生物学技术很多，在这一节里我们只能有选择地介绍一些适用于一般临床实验室，并与疾病的诊断有关的技术原理和概况，具体的操作有专著可供参考。

2.1 分子生物学检验室必需具备的基本条件:除了必须具有分子生物学基础理论知识和经过培训的专业人员以外，在物质条件方面也必须达到起码的要求。包括:合格的清洁级的专用实验室、台式低温高速离心机、DNA扩增仪、准确的加液器、凝胶电泳仪、紫外线观察装置、小型振荡器、纯水制备装置等等。

2.2 核酸的提取与纯化:自细胞或体液中提取核酸，是分子生物学检验过程中最早也是最关键的一步，这一步如果DNA或RNA没有提取到或被外源DNA污染，或RNA被广泛存在的RNA酶降解破坏，或提取液及提取操作不适当，导致RNA或DNA变性、破坏等，均可导致整个试验失败。目前已有多种DNA和RNA提取的装置和药盒商品出售(其中甚至包括无RNA酶的水等)，使用方便，能保证提取成功。

2.3 核酸的分子杂交— 基因探针技术:是临床应用最早的分子生物学技术，至今仍常盛不衰。它不仅用于微生物等基因鉴定方面，而且在印迹技术(如southern blot)方面以及新近成为热门的所谓“基因芯片”技术方面都有广泛应用。不少探针已商品化。

2.4 PCR技术:这是一种体外模仿体内DNA复制(扩增)过程的技术。可以在短时间内大量复制出原来很少的DNA，用于诊断、鉴定、科研、制备探针和进一步结合基因工程进行产品开发等，是一项极其有效、非常实用的技术，目前已衍生出许多新方法，如定量PCR，巢式PCR，不对等PCR等。因其已相当普及，本文从略。

2.5 DNA(基因)酶切图谱分析:用特定的限制性酶消化(水解切断)DNA长链后，可以得到核酸的片段。由于不同的DNA碱基序列不同，用识别某一特定碱基序列的限制酶进行酶切时，所得到的DNA链片段的长短也不一样。片段的长短可用凝胶电泳进行分离后，与一系列已知分子量(或碱基对，bp)的标准参照物(或称标志物，marker)进行比较，大体计算出各片段的分子量或bp数。这一方法已广泛应用于临床基因诊断。例如，当一个基因发生点突变后引起某一限制酶识别点改变，就可以用本法检测出来。临床和科研中已沿用多年的DNA限制性片段长度多态性分析(RFLP)，就是本法具体应用的典型例子。在人群中，各个体基因的核昔酸序列会存在一定差异，称为基因多态性。基因多态性位点普遍存在于人的基因组中，并按孟德尔遗传方式遗传。如果在某个家庭中，某一致病基因与特定的多态性片段紧密连锁，就可以用这一多态性片段作为一种“遗传标记”来判断家庭成员或胎儿是否携带有致病的基因。目前认为基因多态性是个体的“身份证”;有的虽然不表现疾病，但也许会影响对药物的反应和用药效果，因而有人提出将来会出现按个体基因型选择用药的种类和剂量的所谓“个体化”用药。

2.6 单链构象多态性(SSCP)分析:这是一种简单、有效、快捷、廉价的检测非常少量的基因组DNA或cDNA突变的技术。其原理及技术要点是:由于单一碱基的替代(改变)，引起DNA链构象改变。后者可导致DNA在非变性凝胶电泳中出现迁移率的改变。因此，首先用PCR技术扩增所检验的模板，然后进行变性、电泳、显示。根据显示的条带与正常对比，即可判断所测DNA链是否有变异。

2.7 DNA序列测定:上述方法仅能大致了解某一核昔酸链片段是否存在变异，并不能确定哪一位点核昔酸发生变异和何种核昔酸取代了何种核昔酸，这就要求进行基因测序。关于DNA测序的方法，因其十分复杂，一般临床实验室无法进行。有必要时可委托有条件的公司或研究机构进行，本文从略。由近几年世界范围进行的人类基因组计划(其主要步骤是基因测序)可知，当今基因测序是一项大规模工程，可以自动化进行。

2.8 DNA微阵列(DNA microarray)技术或蛋白质微阵列技术，又称生物芯片(biochip)技术:这是当前分子生物学领域最热门的技术，国内外正在竞相开发，刊物上已有大量介绍，本文不拟重复，只简要介绍其一般概况和应用前景。微阵列技术的大致步骤是:在一小片固相基质(如修饰过的玻璃或尼龙膜片)上，高密度地点上成千上万个DNA片段，制成微阵列— 即DNA或生物芯片。检测时采用分子杂交手段，将荧光标记的标本与微阵列进行杂交，杂交完成并洗涤后，用激光共聚焦显微扫描仪检测荧光信号，通过微机处理分析，即可获检测结果。目前国内外已制出多种生物芯片商品，其实际应用亦已逐步展开。据文献报道，微阵列技术应用范围极广，如致病微生物的检出、癌基因及抑癌基因的检测、组织配型、基因表达的研究、基因功能分析、基因制图、基因突变和多态性的检测等，是一项非常有发展前景，适合临床检验应用的先进技术。

2.9 荧光原位杂交染色体分析(FISH):这是一种在染色体上进行基因定位的技术，其基本原理和步骤是:在已经知道某靶基因核昔酸序列的前提下，先合成与靶基因互补的经荧光标记的DNA探针，与常规方法制备的中期染色体进行原位杂交。在荧光显微镜下可以观察到该靶基因所在的染色体(臂、区、带、亚带)。这是一项非常有用的技术，它不仅可用于基因在染色体上定位的研究，而且可直接用于实验室诊断。例如，慢性髓系白血病患者的9号与22号染色体的长臂相互易位所形成的Ph染色体，形成了一个融合基因— bcr-abl(并编码表

达一种叫P12 OBCR/ABL的蛋白质)，这是该病发病的重要因素。早先用染色体分析鉴定这种染色体变异，准确性差，阳性率也不高。改用bcr-abl基因探针进行原位杂交很容易鉴定，并且不一定需要分裂中期的染色体，在核内处于间期的染色体也可检出。目前在各类白血病中，已鉴定出好几种类似的融合基因。为此，当前对白血病的实验室诊断，已由过去的M(形态学)、I(免疫学，即细胞表面分化抗原CD)、C(细胞化学染色)改为MICM，后一M即指分子生物学。FISH在基因定位研究和诊断中的应用还很多，兹不赘述。

2.1 0 蛋白质组及分析技术:蛋白质组(proteome)一词，是由蛋白质(protein)和基因组(genome )两个词组合而成的一个新词，意指基因组编码的全部蛋白质。目前兴起的蛋白质组学(proteome science或proteomics)， 就是从蛋白质组水平研究生命活动的学科。当前人类基因组的研究热火朝天，人的基因组DNA序列测定已大体完成，但这只是探索人类生命活动的第一步。因为这些DNA序列中哪些是基因?表达什么样的蛋白质?甚至基因组DNA中究竟含有多少基因还远未完全弄清。基因本身不具有生物活性，它所表达的蛋白质才是生命活动的具体执行者。一切生命活动均与蛋白质有关。因此，测定细胞、组织以及体液中的蛋白质较基因分析更具有现实的生理、病理及临床意义。存在某种基因并不意味着它就表达某种蛋白质，因为基因会不会及何时被转录、翻译成蛋白质、达到多大浓度等均受诸多机制调控。此外，蛋白质的结构远比基因复杂，它往往由不止一条肤链，构成多种同型体(isoform，例如各种酶的同工酶等)。更重要的一点是，翻译成的蛋白质往往还要再经过所谓“翻译后修饰”如糖基化(加上多糖链、唾液酸等)、磷酸化、乙酞化等等。这些修饰过的蛋白质不但在用电泳等方法进行分离时出现差别，而且在功能上也往往有一定差别。因此，有人讲，如果说人类有十万个基因，那就可能有上百万种蛋白质，这些蛋白质的质和量的变化，蕴含着病理生理意义，是历来临床生化着力研究的重要课题。蛋白质组分析技术:要想大规模测定细胞、组织乃至体液中的全部蛋白质，在技术上的复杂性和难度比一般的基因分析要大得多。相对于蛋白质来说，基因— DNA或RNA结构较简单，它们只有4种核昔酸所构成，(人的蛋白质则由20种氨基酸构成);其次级结构也不像蛋白质那样复杂;可以运用PCR等技术加以扩增，并且比较稳定。而从细胞、组织、体液中测定蛋白质组，首先要用复杂精细的技

术将各种蛋白质进行分离，然后进行特性鉴定。这种方法不像基因序列测定那样可以大规模自动化进行，这就是为什么蛋白质组分析发展较慢的主要原因。但近年来由于受基因组技术的推动，蛋白质分离技术有了很大发展，使其日渐成熟，部分实现了自动化，并且与现代的图像识别技术结合，使蛋白质组技术进人临床及科研使用成为可能。当前的主要技术包括:双向(二维)聚丙烯酞胺凝胶电泳(结合等电聚焦和PAGE)分离蛋白质，在固相载体上形成蛋白质— 多肤图谱，用敏感的方法染色(如银染)并用图像分析电子计算机进行鉴定;将蛋白质点切下，用酶消化，进一步用氨基酸分析、质谱分析等进行鉴定;或结合蛋白质的毛细管电泳，HPLC以至蛋白质芯片进行鉴定。大量的定性、定量数据处理分析以及与正常的蛋白质库进行比较，以至模拟蛋白质二、三级结构等均由电脑(以特定的软件)来完成。这一工作和基因组分析大量信息处理一样，称为生物信息学(bioinformatics)有人把这种工作叫作干(dry)化验，而将传统的实验室操作叫湿(wet)化验。目前已有一些专用、配套的蛋白质组分析仪器及专用软件商品供应，并在不断改进中。以上介绍仅是一个大概，日前国外这方面的报道越来越多，国内已有少数单位着手进行这项工作，预示着继人类基因组分析之后，一个蛋白质组研究和应用的时代即将到来。

3．问题与展望

分子生物学是一门正在蓬勃发展的新兴学科，尽管近年来关于分子生物学方面的文章占了国内外生物一医学刊物的大部分篇幅，并且新的技术和应用不断涌现。方兴未艾，但真正适合临床检验常规应用的还不多。其主要原因除了有的新方法还不十分成熟以外，方法相对较复杂，商品化的药盒和专用设备价格高昂，病家难以承受。以基因芯片为例，目前尚处在开发研究阶段，距临床实用还有一段距离。另外有些临床试验，现有的方法已相当完善，虽然也可以用分子生物学方法，但未见有多大优越性。例如日常检测HBV已有很多好方法，其敏感性和特异性都不差，因此除特殊情况外，一般无需用分子生物学方法检测。以PCR为例，即使是发达国家，虽然研究得轰轰烈烈，但临床检验实际应用的却很少，蛋白质组分析技术还刚刚起步。尽管如此，我们仍然要努力学习和大力传播分子生物学知识和最新信息。因为随着研究的深人和大规模商业开发，今天技术复杂、价高的试验，明天就可能方法简化、价格降低，达到普遍应用的要求。现阶段我们的任务是加强学习，关注新动向，在理论上有所准备。因为从发展的眼光来看，分子生物学方法定会越来越多地在临床检验中推广，这是必然的。

省略了原文中的图表及图（照）片，如对本文感兴趣，请参阅 江西医学检验2001年第3期。