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蛋白质组学在病原微生物基因功能研究中的应用

袁静

来源：检验医学专题网   摘自中华检验医学杂志   加入日期 2008-04-15

蛋白质组学及比较蛋白质组学主要通过基因组测序信息鉴定菌株中的独特性蛋白质，获得表型水平上菌株差异的相关信息，并对特定的细胞组分进行分析。因此，通过对致病性不同的病原微生物菌株及致病菌株与非致病菌株的比较蛋白质组学研究，可发现和鉴定与毒力相关因子、抗生素与化学制剂的抗性，以及菌株分型相关的分子标志，从而解析其致病机理，同时发现的致病菌株中特异的基因和蛋白质，还有可能成为新型治疗方法或诊断方法上有潜力的靶标，对制药工业具有非常高的应用价值。

一、蛋白质组学在病原微生物致病机理研究中的应用

病原微生物的蛋白质组学研究，可以了解其毒性因子、抗原和疫苗的制备，对疾病的诊断、治疗和预防非常重要。结核分枝杆菌是病原微生物研究的一个重点，Jungblut等对结核分枝杆菌H，Rv和作为疫苗的BCG菌株(BCC Chicago)的比较蛋白质组分析，有毒和无毒的菌种之间存在25种重要蛋白质的差异，包括rplL和IJeuA编码的持家蛋白质、潜在致病性因子和一些假想蛋白质；BCG菌株与致病的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(M．bovis)相比有3个片段缺失，包括含8个ORF的RD1，而且BCG中额外有1O个蛋白质表达。当将RD1区转入BCG菌株后，其形成的蛋白质谱就与牛分枝杆菌类似，说明RD1区的缺失可能抑制了分枝杆菌中一些蛋白质的合成，使BCG菌株的毒性降低。Monahan等 对感染THP-I细胞的BCG菌株研究发现有6种蛋白质的表达量增加，即16 000的Hspx(晶状体球蛋白)、GmEL．1、GroEL-2、一个31700的假想蛋白(Rv2623)、InhA和延伸因子Tu(Tuf)，这些都可能是体内诱导表达的毒力因子。大肠杆菌(Escherichia coli)536菌株有4个毒力岛(PAlsI 536到Ⅳ 536)，PAl II 536的缺失造成Leux失活，影响很多毒力特征的出现。对E．eoli 536、突变株536-21(PAlI 536^-，PAI II 536^-，leu X^-)、536-5102 (PAI I 536 ，PAI II 536 ，leuX^-)和536．13 (PAl I 536。，PAI II 536^-，leux^-)的双向电泳分析发现有39个蛋白质表达有很大差异，说明PAl I 536，PAl 1I 536等的存在影响到很多大肠杆菌中持家基因的表达。      

Thulasiraman等用表面增强激光解吸离子化(SELDI)蛋白质芯片技术研究鼠疫耶尔森氏菌温度调节和钙调节的毒力因子，对在26℃和37℃生长的鼠疫耶尔森氏菌进行分析，发现在37℃条件下有5个蛋白质上调，同时有3个蛋白质下调，在37℃条件下主要表达的两个蛋白质分别为过氧化氢酶和抗原4。此外，通过蛋白质组分析对培养基和细胞内生长的细菌进行比较，发现感染巨噬细胞的军团菌、布鲁氏菌、沙门氏菌中分别有一些特殊蛋白被诱导或被阻遏。2000年，Langen等 分析铜绿假单胞菌细胞膜和培养滤液中菌株间的差异，发现至少4o个新型有潜力的标志物，这些标志物本身无法借助基因组测序确定，而由蛋白质组分析得到的微生物变异程度比在DNA水平上要高。此外，蛋白质组学研究可作为致病微生物临床隔离群区分的可靠参数之一。Jungblut等对4个幽门螺杆菌临床隔离群的比较蛋白表达图谱研究发现，按地区来源可以明显分成两组。对29株李斯特菌属(Listeria)分离株的蛋白质组研究可归为6个亚类，其中19株产单核细胞李氏菌分为2个簇，这些与其他方法所得结果一致。在对流感嗜血杆菌研究中发现，实验室培养的和临床分离的遗传背景相同的菌株出现了新的ORF，对临床分离株NCTC8143进行双向电泳，发现色氨酸酶的含量较高，而实验室培养的菌株中则没有色氨酸酶。

二、免疫蛋白质组学在病原微生物潜在疫苗研究中的应用

免疫原性蛋白质在病原微生物致病过程以及预防、诊断和治疗中有很重要的意义。近年来，免疫蛋白质组学(immunoproteomics)已广泛地应用于宿主对病原微生物的体液和细胞免疫应答研究中，嘎氏疏螺旋体(Borrelia garinii)和幽门螺杆菌是最早通过免疫蛋白质组学而被研究的2种细菌。

嘎氏疏螺旋体是莱姆病(Lyme disease)的病原，Jungblutm通过免疫蛋白质组学手段，利用感染早期(红斑迁徙期)和晚期(出现关节炎、四肢皮炎等症状)患者的血清研究了嘎氏疏螺旋体的免疫原性蛋白，在验证了传统使用的2个靶标抗原的同时，又寻找到了2个新的靶抗原：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和寡肽ABC转运蛋白；同时还发现了一些不同感染阶段特异性的抗原，为其诊断及感染阶段的确认提供了很好的靶标。

幽门螺杆菌研究中已发现的有保护作用的抗原有：尿素酶、VacA、CagA、过氧化氢酶及热休克蛋白等。据报道对26695、G27、z-170菌株的蛋白质组与感染患者的血清或血清库进行免疫杂交，通过免疫杂交得到的抗原性的蛋白，大多数相对分子质量大小在40000～60000之间，等电点在4．9～6．4之间，其中尿素酶B亚单位(Hp0072)、GroEL(HpO010)、异柠檬酸脱氢酶(Hp0027)在3株菌的研究中都被发现，应用动物模型已经证明是具有保护作用的抗原。Kimmel通过对G27菌株的研究，认为在代谢过程中有抗原性的酶，不与未感染患者的血清发生交叉反应，并且在I型和Ⅱ型菌株中具有高度保守性，可以作为血清学检测试剂的候选抗原分子。Haas 用不同胃部疾病患者血清对幽门螺杆菌26 695菌株进行2DE后，对抗原识别谱进行分析，鉴别了仅与幽门螺杆菌感染活动期患者的血清有免疫反应的7个蛋白质，其中HtrA、Cag3和Hp0231是新发现的特异性抗原。在研究中还发现有些蛋白质如30S核糖核蛋白S5、延胡索酸还原酶、信号识别蛋白等，也以某种模式被溃疡病患者血清识别，已发现了一系列抗原用于诊断分析和抗原设计。Pitarch等 从白假丝酵母中鉴定到了42个有免疫原性的持家酶，进一步研究发现在念珠菌病发病过程中，磷酸甘油酸激酶与乙醇脱氢酶抗体的产生与刺激人的免疫分化有关，并验证了循环系统中自假丝酵母特异性抗体对念珠病发展的抑制作用，认为高浓度的抗烯醇酶抗体的出现标志着患者处于恢复期，可作为一种病情发展的标记物，此研究为念珠菌病的早期检测及临床跟踪提供了靶标，且可能被用作抗真菌药物及疫苗设计的靶标。Shin等 分别用IgM、IgE、IgA和IsG去探测Neospora caninum的免疫原性蛋白，发现HspT0、丙酮酸激酶、肌动蛋白、NADG-1、微管蛋白链以及推测的核糖体蛋白s2为IgM、IgE和IgG或IgM和IgG共有的免疫原性蛋白；而NTP酶、Hsp60、微管蛋白B链、假想蛋白质二硫键异构酶、烯醇酶、乳酸脱氢酶、丝氨酸一苏氨酸磷酸酶以及GRA2为IgM、IsE和IgA共有的免疫原性蛋白，而且大多都与侵袭、增生及发病有关。经进一步分析后认为，HspT0、肌动蛋白、NTP酶、Hsp60、丙酮酸激酶、烯醇酶、假想的核糖体蛋白s2、NCDG．1及GRA2有可能成为诊断及疫苗研究的靶标。Chakravarti等 设计了结合基因组学、转录组学、蛋白质组学和生物信息学寻找疫苗候选者的方案，他们预测了流感嗜血菌Rd基因组中一个潜在的疫苗候选者——外膜脂蛋白f16，寻找与单抗相互作用的蛋白质。目前免疫蛋白质组学已成功地应用于生物医学的许多领域，也应用于不同种类免疫反应以及免疫反应过程中不同阶段特异性免疫蛋白的研究，以及通过磷酸化抗体来探测被检测蛋白质中磷酸化情况等蛋白质翻译后修饰的研究。此外，Vytvytska 圳对耐药性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)进行了免疫蛋白质组分析，发现了几种高度血清敏感性的抗原，它们可能作为疫苗的候选抗原分子。Wang用免疫兔子制备的繁殖体血清研究了炭疽芽孢杆菌野生株A16、疫苗株A16R以及2个致病质粒均被去除的A16W三者分泌蛋白中的免疫原性蛋白及其差异。Peng等和Ying等 用免疫鼠制备的血清及免疫兔及猴制备多抗血清，从分泌蛋白、外膜蛋白及疏水蛋白中鉴定到了23种免疫原性蛋白，其中15种为新抗原。Chen等驯从嗜水气单孢菌的外膜蛋白中筛选出一个保护性达71．4％ 的保护性抗原。

三、蛋白质组学在病原微生物药物抗性基因功能研究中的应用

比较蛋白质组学可以进行微生物抗性机理的研究，已发现在Rif抗性脑膜炎奈瑟菌中有一个相对分子质量为18 9OO的蛋白质等电点向酸性迁移，B内酰胺类抗生素抗性的铜绿假单胞菌中缺少相对分子质量为47 000的膜蛋白，青霉素抗性的肺炎链球菌诱导相对分子质量为38 500的磷酸甘油醛脱氢酶的合成等。Sinsh等在研究金黄色葡萄球菌时发现，作用于细胞壁的抗生素苯唑西林、头孢噻吩、万古霉素等能引起至少9个蛋白质表达量增加，已鉴定的5个蛋白质分别是：甲硫氨酸亚砜还原酶(MsrA )、信号转导蛋白(TRAP)、转录延伸因子(GreA)、热休克蛋白(GroES)和烯醇丙酮酸磷酸精磷酸转移酶系统的一个组分。通过比较内酰胺抗生素、甲氧西林耐药菌株和敏感的金黄色葡萄球菌菌株，这些菌株在基因组和蛋白质组水平显示高度相似性，至少有15个主要蛋白质与耐药表型相关。DiCes等 对Divercin V41抗性和野生型的产单核细胞李斯特氏菌进行2DE分析，发现至少在17个蛋白质存在差异，抗性菌株中缺乏野生型菌株中的9个蛋白质，而新增8个蛋白质，其中只有1个RI是存在于已知该菌的数据库中，为鞭毛蛋白；他们还鉴定到抗性菌株中缺乏而野生型菌株中含量较高的与Dps蛋白类似的铁蛋白86，这两种蛋白的转录调节都与仃因子有关。

机会致病真菌如念珠菌属产生了许多的耐药菌株。最近研究发现，伊曲康唑(Echinocandin)类化合物通过抑制真菌细胞壁的d-葡萄糖的合成而起作用，而且对耐真菌药物的菌株起作用。Bruneau等 对比mulundocandin、氟康唑和伊曲康唑3种杀真菌药处理所产生的白色念珠菌双向电泳差异蛋白质图谱后认为，氟康唑和伊曲康唑在蛋白质组水平具有共同的作用机制。最近，Lilly实验室的Echinocandin及Memk公司的Pneumocandin已在进行I期和Ⅱ期的临床试验。

Kahng等 对不动杆菌的碳源分解代谢进行研究，生长在琥珀酸盐或p-hydroxybenzoate培养基不动杆菌属的A．1wofii K24(可以分解磺胺药物前体aniline)，对比它们经QSepharose柱分离后的双向电泳蛋白质图谱，用N端测序和内部测序(ESI．MS／MS)鉴别了差别表达的两种原儿茶酸_3，4．二加氧酶亚基pcaH和pcaG ，它们都与p-hydroxybenzoate的分解代谢有关，可能是该菌株耐药性产生的主要原因。因此，病原微生物的耐药菌株和敏感菌株的比较蛋白质组学研究，对阐明耐药相关机制、鉴定新的药物靶位和耐药诊断标志有非常重要的价值。

四、病原微生物不同生理状态下比较蛋白质组学研究其基因功能

细菌对一个既定刺激做出反应与蛋白质的表达密切相关，可能作为反应效应的指示剂，从而揭示病原微生物对某种生态环境的适应性、对各种底物的利用及病原微生物的应激反应。Cordwell等。拍和Krah等研究发现通过限制营养物可导致细菌细胞的扩大，产生趋化作用，而这些变化可能仅仅受1或2个调控蛋白质的直接控制，其他间接效应可能是由于蛋白分子伴侣的表达上调以及细胞表面活性结构的表达，这些反应对于宿主内的致病菌特别重要，对环境的感应可促进病原微生物中各种毒素以及膜相关运输蛋白等细胞表面致病因子的产生。Guerreiro 等 研究了正常和应激条件下采用( S)甲硫胺酸标记病原微生物，比较热和冷休克反应、乙醇和过氧化氢诱导下病原微生物的双向电泳结果，研究在营养物限制条件下细胞适应效应，解释与不同条件相关的代谢途径，从而确定对一种条件反应相关的刺激元和调节元。对衣原体属中肺炎衣原体和沙眼衣原体的致病机制及潜在毒性已进行了深入的研究。Shaw等 补充了沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的蛋白质组，比较胞外传染性原生体(EB)和胞内网状体(RB)，发现了一个全新的204bp、7 000的网状体蛋白(Rbp一7)，它在EB—RB循环中产生，只存在于胞内网状体内并迅速降解，提示其潜在的致病机制。另一个研究小组用 s标记的沙眼衣原体蛋白质，对比体外 -干扰素处理或未处理的持续感染的肺炎衣原体Hep-2细胞，研究体外干扰素处理后肺炎衣原体的一些病原体蛋白质(如OMP、Hsp-60／GroEL、GyrA)、转录相关蛋白(RpoA、PnP)、翻译相关蛋白(Rrf)、糖酵解(PgK、G1gP)，Ⅲ型分泌系统(sctN)的表达情况，提示干扰素的药物作用机制。支原体(Mycoplasma)造成的危害非常广泛，研究较多的是肺炎支原体(M．pneumoniae，MP)和生殖器支原体(M．genitalium，MG)。Regula等 鉴定了224个基因产物，初步建立了肺炎支原体蛋白质组数据库；Ueberle等 则在此基础上，将差速离心、阴离子或阳离子交换层析、肝素配体的亲和层析、固定的抗生蛋白链菌素分离、生物素结合蛋白质等新方法用于肺炎支原体蛋白质组数据库的扩充，对305个基因产物进行了分离鉴定。生殖器支原体基因组仅为580 000 bp，只有480种基因表达产物，对其菌体进行双向电泳，质谱鉴定到158种蛋白质；在指数生长期后，DnaK、GroEL、DNA 回旋酶和细胞粘连附属蛋白高表达，一些核糖体蛋白质表达下调；Balasubramanian等 将生殖器支原体的所有483个ORF分类，研究其中25个未知同源结构及功能可读框，采用基因敲除技术从构建系列基因敲除突变体，分析突变体与野生株表达的差异蛋白质，并用圆二色性(Circular dichroism ，CD)等方法分析它们基因产物的生物物理学及三维结构的特性，发现病原微生物中一些代谢途径的内在机制，包括外多糖的生物合成、对营养物限制的反应、sigma因子的灭活和细菌数感应等机制，并建立了生殖器支

原体的蛋白质组数据库：http://bioinfo.mbb.yale.edu/Genome。

几乎所有的螺旋体(Microbes spirillum)对人类都是有害的，其中钩端螺旋体属(Leptospira)危害尤其严重。针对钩端螺旋体的两个不同致病性的菌株以及它们在不同生长条件下的蛋白质组进行比较，使用双向电泳、质谱鉴定技术、液质联用技术和同位素标记定量技术，对这些菌株进行分析，发现它们在蛋白质组水平上有许多重要的差别，为进一步的药物和疫苗开发提供了条件。

五、小结

蛋白质组学不仅提供了确定人类基因组在疾病期表达的蛋白质治疗靶点的方法，也提供了鉴定病原体蛋白质组内的靶标的许多策略，因而它能够引领针对传染病的药物和疫苗研究。病原微生物蛋白质组学的研究必然在明确病原微生物感染过程、新药及疫苗的开发和应用以及完善高等生物蛋白质组学研究策略等方面发挥重要的作用。

省略了原文中的表格及图（照）片，如对本文感兴趣，请参阅《中华检验医学杂志》2007年第30卷第6期