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尿海藻糖酶与临床研究进展

来源：检验医学专题网     加入日期 2007-12-01

由于NAG、GGT、β2一MG、α1一MG、RBP等的分布是非特异性的，除肾脏外，在其它组织亦有分布，故其升高不能特异地定位于近端肾小管。此外，β2一MG、α1一MG和RBP在血中浓度较高，且分子量较小，它们在尿液中的浓度尚受血中浓度及‘肾小球滤过率的影响。由于尿海藻糖酶特异地定位于近端肾小管上皮细胞，而且在尿液中浓度极低，特异性及敏感性好。因此，在近端肾小管损害的早期诊断上，测定尿海藻糖酶是一种更理想的方法。

1 海藻糖酶的特性介绍

1．1 理化特性 

海藻糖酶是一种胞外酶，位于哺乳动物肾和小肠上皮细胞膜的刷状缘，国际酶学编号为EC3．2．1．28，属于水解酶类，它能催化水解一分子海藻糖生成两分子葡萄糖，且底物作用是高度专一的。海藻糖酶的等电点为4.37，在正常体液pH7．4时带有大量负电荷。该酶已从哺乳动物，肾脏中提纯，经SDS—PAGE电泳显示出一个75kDa的分子带。海藻糖酶的cDNA已从家兔、人、和鼠组织中分离出来。人海藻糖酶cDNA完整序列显示，该酶由583个氨基酸残基组成，在氨基端含有一个由19个氨基酸残基组成的典型的可切信号肽，在羧基端含有5个潜在的糖基化位点和—个疏水区。尿海藻糖酶通过糖基化磷脂酰肌醇连接于肾小管上皮细胞膜刷状缘，需特异的磷脂酶C水解才能将其完全从上皮细胞膜释放出来。

1．2 生物学特性

在肠道由海藻糖酶水解海藻糖生成的葡萄糖可能作为能源被吸收利用，有报道，缺乏海藻糖酶的患者在食了含大量海藻糖的蘑菇后引起腹泻，而肾海藻糖酶的功能目前还不清楚。有报道说，尿海藻糖酶活性升高与近端肾小管损害和某些种类的肾疾病有关。

2．海藻糖酶的临床应用

2．1 急、慢性肾小球疾病

慢性肾小球肾炎、肾病综合征和慢性肾衰患者的尿海藻糖酶活性均升高。已有报道说，急性肾病综合征患者尿液NAG活性升高。这些作者得出结论：急性肾病综合征患者可能有肾小管损害。其他调查也显示NAG活性升高和肾病综合征的复发有关。尽管肾小管损害患者尿NAG活性比对照组高1．5～5倍，而ELISA法测定的尿海藻糖酶蛋白浓度比对照组高6.2～200倍。

sasai—Takedatsu等也报告，在近端肾小管损害患者，尿海藻糖酶活性升高早于NAG活性升高。因此，肾小球疾病如急性期肾病综合征患者尿海藻糖酶浓度显著升高暗示肾小管细胞已高度损害。急性期肾病综合征患者尿海藻糖酶蛋白含量比健康对照组高200倍，而缓解期患者与健康对照相比并不升高：沙门菌感染引起急性肾衰的患者尿海藻糖酶活性很低，但是用ELISA方法测定的麓蛋白的含最则显著升高，是对照组的27倍，这可能是由于海藻糖酶的活性中心在爆发感染时被破坏而导致酶活性丧失。

2．2 监测重金属盐中毒与药物的肾毒性

有调查报告，在氯化汞诱导的肾中毒家兔和Itai-Itai病患者以及镉污染区的居民，其尿液中海藻糖酶的活性均升高。另有人报道氨基糖甙类药物妥布霉素和氨苄青霉素合用导致肾小管细胞损害，检测尿海藻糖酶活性明显升高，且早于NAG活性升高，其与肌酐的比值(T/Cr)大于NAG/Cr。

2．3 肾小管一间质疾病

在肾小管性酸中毒、感染性或药物性间质性肾炎、肾移植排斥反应等损害肾小管，尤其是近端肾小管的疾病，测定尿液中海藻糖酶可作为协助诊断、观察病情及估计预后的一个灵敏而特异指标。

2．4  遗传性疾病

Lowe综合征是一种x一性连锁隐性遗传病。Ishihara R等报导Lowe综合征患者尿海藻糖酶蛋白含量比对照组高200倍。婴儿型多囊肾为常染色体隐性遗传性疾病，该病胎儿羊水中海藻糖酶含量明显升高，测定该酶有助于早期诊断及优生优育。

3  尿海藻糖酶的测定方法

3．1 酶活性的测定

3．1．1 原理

利用海藻糖酶水解一分子海藻糖生成两分子葡萄糖，然后测定生成的葡萄糖浓度作为海藻糖酶的活性浓度。

3．1．2  步骤

将尿液标本0.5 mL通过5mmol／l  pH为6.2的磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex G一25柱，以除去内源性葡萄糖。收集含蛋白的部分，将体积调整到1.5ml。，将洗脱下来的标本0.9mI。加上0.1mL  0.25mmol／L的海藻糖，混合后于37℃温育120 min。生成的葡萄糖用POD—GOD方法测定，以每小时每升尿液中释放多少umol的葡萄糖量作为海藻糖酶的活性浓度。

3．1．3  结果

Ishihara R等测定健康组尿海藻糖酶的活性是26.6±14”umol·h^-1．g creatinine^-1。

3．2 酶含量的测定

3．2．1 原理

利用抗海藻糖酶单克隆抗体的夹心ELISA方法检测酶蛋白的含量。

 3．2．2 步骤

国外报导用重组海藻糖酶和人工合成的海藻糖酶多肽片段制备出抗人海藻糖酶的单克隆抗体，然后经过包被、封闭等步骤，用夹心ELISA方法测定出酶蛋白的浓度。

3．2．3 结果

Ishihara R等用ELISA法测定健康组尿海藻糖酶蛋白的浓度为466±343 ng·gcreatinin^-1。健康实验者的尿海藻糖酶活性和含量之间有正相关(p<0．01，r=0.15)““。这些数值均无性别及年龄差异。

海藻糖酶在正常人尿液中的活性很低，而且尿液中该酶活性是否能反映真实酶浓度也不确定。急性肾衰患者尿液中存在75kDa和30kDa酶蛋白分子，30kDa酶蛋白分子也许是蛋白水解酶降解完整海藻糖酶的产物，尽管尿液中存在75kDa酶蛋白分子，该患者尿海藻糖酶活性并不升高，说明尿液中酶活性已丧失，由于经典测酶活性方法的影响因素多而且灵敏度和特异性均不及免疫学方法测酶质量。因此，尿海藻糖酶的定量测定优于传统的酶活性测定。

4．尿海藻糖酶定量测定的技术要点

4．1 人工海藻糖酶多肽片段的合成和重组海藻糖酶的制备

国外采用标准9一甲氧羰基荧光素固相合成法合成氨基酸残基序列291～307肽段(SKDVEIADT[~PEGDREA)。用反相高效液相色谱法(HPLC)分析并提纯多肽。HPLC主要是根据分子的亲水性(反相)和电荷(离子交换)方面的差别来实现样品的分离的。反相HPLC的优点是分辨率大。利用分子生物学方法表达出的重组人海藻糖酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化后也可以作为一种免疫原。

4．2 抗海藻糖酶单克隆抗体的制备

通过腹腔注射加佐剂的重组蛋白或合成的多肽来免疫8周龄的雌性小鼠BALB/c，第一次免疫问隔两周后，每周连续注射3～4次。最后一次注射后3～4天杀死小鼠，用改良的Kohler和Milstein方法将脾细胞与B细胞瘤株P3一X63一Ag8融合。细胞融合产生8种杂交瘤克隆株：KM2275、KM2276、KM2285～2290，单克隆抗体KM2275和KM2276是由重组海藻糖酶免疫产生的抗体，其他抗体是由合成多肽免疫产生的。抗体KM2275和KM2287与重组海藻糖酶和尿液中的海藻糖酶均有良好反应。

4．3 夹心EI,ISA方法的建立

用单克隆抗体KM2287包被ELISA反应板小孔，用生物素标记单克隆抗体KM2275，用HRP标记链霉亲和索，采用生物素一亲和素夹心酶免疫测定办法；，lshihara R等测定了该方法的最适工作条件：尿液标本测定前需经凝胶过滤；尿液过滤后需用含1 g／L SDS的PBS稀释10倍；最适pH为6．0～8．0。当尿液贮存于-60℃、-30℃、或4℃30天．酶蛋白含量均未下降。可能影响的物质如维生素C(10g/L)、葡萄糖(100 g/L、白蛋白(10 g/L或肌酐(1 g/L)均不影响该ELISA方法。

5．国内应用前景

近年来的研究发现，肾小管-间质损害是决定肾功能减退的主要因素，而近端肾小管的损害义是肾功能恶化的重要原因。早期发现肾小管损害是锰床诊断和治疗的关键，而尿海藻糖酶在肾近端小管损害方面具有早期、特异、灵敏的诊断价值，目前国内实验室尚未开展此项检测，临床应用前景很大。当前首要的工作是用分子生物学方法制备出重组人海藻糖酶蛋白并加以提纯，然后制备出抗海藻糖酶的单克隆抗体，继而建立快速高效的ELISA检测方法，使海藻糖酶的测定广泛应用于临床检验工作，更好地为临床诊断服务。