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基因组学、蛋白质组学、抗原组学与疫苗的发展

王洪海  祝秉东

来源：检验医学专题网      摘自 国外医学·微生物学分册     加入时间：2008-06-01

实验周期长达数年之久，并且不一定得到最满意的免疫保护效果。基因组学和蛋白质组学的研究为疫苗研究提供了新的技术手段，将极大地加快疫苗的研究步伐。现在已有395种细菌和172种病毒的基因组被测定(http://wwww.integratedgenomics.com)，为疫苗研究提供了非常有用的信息。通过对基因组信息的分析，筛选候选蛋白质抗原的方法被称为反向疫苗学(reverse vaccinology)，包括以下主要步骤：从病原体基因组中分析可能的蛋白质抗原；将它们高通量克隆并表达；进行体内或体外免疫学实验分析，筛选有效的候选疫苗。此外，比较基因组学、转录组学和蛋白质组学的发展也对疫苗研究起着积极的促进作用

基因组学在疫苗研究中的重要作用

基因组和后基因组研究进展使得抗原筛选发生了戏剧性的改变。首先，基因组序列和生物信息学分析发展速度如此之快以至于一个细菌基因组被完全分析不是几周而是几天，它的注释不仅是限定了总蛋白数和根据预测的功能分成几个组，而是提供了可能的总蛋白在细菌细胞中蛋白定位的信息。对于胞外致病菌，引发保护性免疫反应的许多抗原是分泌型的或者膜相关的，因为它可能和机体免疫系统相互关联。原位分析提出了一个主要用于选择可能的疫苗候选物的重要策略。第2个抗原选择的标准是利用DNA芯片分析疫苗的转录因子来提供的，这个技术提供了病原体全部转录活性的全景图片，因此可以比较在不同地生长环境条件下基因的表达情况。特别是通过分析细菌和宿主相互作用的转录谱，能够得到在感染过程中基因特异性表达的情况，这些基因编码了对于疫苗发展具有潜在价值的蛋白质。蛋白质组学技术是对基因组学技术的补充，也是疫苗发展的有力技术支撑，根据这几项技术可以对存在于病原体的不同成分给予充分详细的定性、定量测定。

(一)综合应用基因组学相关技术筛选候选疫苗

应用生物信息学、DNA微阵列和蛋白质组学技术，互相补充，成功地进行了脑膜炎奈瑟菌(简称脑膜炎球菌)疫苗的筛选。在获取病原体的基因组序列后，芯片分析预测编码分泌蛋白、表面相关抗原和毒力因子，蛋白质组学分析膜相关的蛋白，DNA微阵列鉴定高度表达的基因和体内上调的基因。以脑膜炎球菌疫苗候选抗原分析为例，应用“组学”进行疫苗发现的流程是：①应用DNA微阵列技术鉴定高度表达的基因(约1 000个基因)；② 应用硅片分析膜不相关的蛋白(大约4O0个基因)；③ 加上应用蛋白质组学鉴定的膜蛋白(大约500个基因)；④ 加上应用DNA微阵列技术鉴定的体内上调的基因(大约600个基因)；⑤ 高通量克隆和表达这些基因；⑥体外、体内实验鉴定疫苗候选物。

(二)毒力因子鉴定与疫苗构建

毒力因子往往是疫苗的主要组成成分，因此对病原体毒力相关因子的鉴定是疫苗研究的重要内容。随着比较基因组学和功能基因组学的发展，一些新兴的技术手段可以帮助人们较快地寻找到病

原体的毒力因子，为减毒活疫苗研制和蛋白质抗原筛选提供指导。随着更多的微生物基因组序列被测定，研究工作者可以通过比较种属相近的菌株基因组间的差异，尤其是通过比较同一种属致病与不致病菌株间的差异，快速找到一些毒力的相关因子。DNA微阵列分析是分析基因组差异非常有用的技术手段，尤其是比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)方法克服了对多个相近基因组测序的繁重工作，具有高通量和简便的优点。CGH以基因组DNA为探针，通过差异杂交，揭示目标基因组和参照基因组间缺失(或保留)的区域。尽管CGH有其局限性，但随着数据的积累，将对一些常见致病微生物基因组稳定性和差异作出精确的评价。功能基因组的研究将微生物的基因和其生物学功能(尤其是致病性)联系起来，这对于毒力因子鉴定和疫苗研究有很强的针对性。微阵列表达技术用来检测mRNA的表达谱，可以检测生长环境变化所引起转录组学的改变。应用这项技术可以研究宿主和病原体相互作用过程中，基因表达谱的改变。

通过模拟体内条件，研究病原体针对宿主环境所作出的反应，可以从中选择蛋白质作为候选抗原。例如研究者模拟结核分枝杆菌(简称结核杆菌)感染巨噬细胞后的自然环境，在低氧条件下得到了一些特异表达的蛋白质，这些蛋白质中可能存在非常有价值的保护性抗原，需进一步分析研究。鉴定细菌致病基因的研究方法还有多种，包括体内表达技术( vivo expression technology，ⅣET)、体内诱导抗原技术( vivo induced antigen technology，IVIAT)和基于转座子的信号标记突变(signaturetagged mutagenesis,)等。它们是基于体内实验的一些方法，和基因组学分析具有很强的互补性，两者结合有利于对毒力相关基因的分析。

二、蛋白质组学在疫苗研究中的重要作用

人们设想提取微生物蛋白质后，经双向电泳将蛋白质分开，然后应用特异性免疫血清做Western杂交检测，寻找感兴趣的抗原分子。然后，这项工作相关技术尚不成熟。不过近年来随着双电泳和质谱(MS)检测技术的发展，蛋白质组学有了较大的发展。相关的2个样品通过双向电泳找到差异点，结合质谱检测可以确定差异蛋白。将感兴趣的分泌蛋白、膜结合蛋白和全蛋白组分分别同时做双向电泳分析，对差异点进行质谱检测，就可以筛选到分泌蛋白和膜表面蛋白，编码这些蛋白基因可以作为候选抗原进行下一步的分析。因此将基因组学、比较基因组学和蛋白质组学等分析方法结合起来分析候

选抗原是筛选抗原的有效方法(图1)。在寄生虫疫苗研究中，蛋白质组学有更加重要的作用。由于寄生虫基因组大，一般有上万个基因构成，单纯依靠基因组学没有办法对其抗原进行分析。基于双向电泳、液相色谱和质谱测定的蛋白质组学可以很大程度上更为精确地指出可能的候选疫苗，减少候选疫苗的数目。以血吸虫病为例，血吸虫(schistosomiasis rrIEI1Soni)基因组含280 Mb DNA序列，编码14 000—20 000个基因。通过蛋白质组学的方法，人们成功地分离出尾蚴用来穿透皮肤的分泌蛋白、成虫腺分泌蛋白和位于壳表面的蛋白，这些蛋白作为候选的疫苗抗原用于进一步的研究。通过蛋白质组学的分析，使血吸虫疫苗候选基因从至少14000个下降到100—200个，使得下一步抗原分析易于进行。

三、抗原组学在疫苗研究中的重要作用 如何从抗原组学中获得候选的抗原以发展新型

(一)抗原组学的定义 （省略了部分内容）

(二)抗原组学的应用

近年来研究发现，利用血清学方法鉴定抗原是一种有效的方法，主要是因为：① 病原体诱导的抗体主要存在于血清中，虽然并不是所有的抗体都具有保护作用，但是抗体是相应的抗原在体内表达所产生免疫反应的分子特征；② 应用人血清比应用动物血清具有更大的优势，人类比动物对传染性疾病的反应更敏感；③ 收集多人混合血清，尤其是最明显的细菌等微生物基因组的特点是基因组小，结构紧凑，少内含子，易于进行基因分析。疫苗常为毒力因子、分泌蛋白或膜相关蛋白蛋白，因此编码它们的基因是计算机分析的主要目标。常用的程序包括BL~ST程序以及一些基于分泌引导序列和跨膜区序列分析的软件，应用上述种类软件，通过计算机分析就可以从全基因组序列中搜索到可能的候选疫苗。首次发表的将基因组学应用于疫苗研究的工作是Piz 等对脑膜炎球菌血清型B(MenB)的疫苗研究。MenB是引起脑膜炎和败血症的一种致病菌，应用传统的方法几十年来很难找到其保护性抗原。在其菌株MC58测序后的18个月内，研究人员应用反向疫苗学方法初步筛选到了MenB菌株的候选疫苗，显示了该方法的强大优势。MenB疫苗候选抗原分析的主要步骤包括：① 对编码新的表面蛋白或分泌蛋白的开放阅读框架(ORF)进行了分析，选择570个候选抗原在大肠埃希菌中进行表达。②350个蛋白得到了高效表达，应用纯化蛋白免疫小鼠，得到免疫血清；③应用血清来鉴定位于菌株表面的蛋白，并观察免疫血清的杀菌活性。通过上述标准筛选得到了7个抗原。①进一步分析这些抗原在其他脑膜炎球菌的序列保守性，最终选择保守性高的2个抗原用于进一步的疫苗研究。目前这2种疫苗已进人I期临床试验，实验证明运用反向疫苗学是成功的。继MenB疫苗研究成功后，人们应用反向疫苗学方法对其他病原体展开了研究，包括肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、啼炎衣原体和结核杆菌等。在此过程中，反向疫苗学的方法也得到了逐步的改进。经过基因组学分析得到的文库可能很大，给进一步分析候选抗原造成困难。DNA微阵列分析、比较基因组、功能基因组(包括转录基因组学和蛋白质组学等)分析可以更加明确靶抗原，加快疫苗的研究。

蛋白质抗原呈递大都受主要组织相容性复合物(MHC)限制，因此还可以根据结构生物学等相关的分析软件对疫苗表位进行筛选和预测。MHC I类分子呈递8～10个氨基酸的肽片段给CD8 的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，所识别序列主要与一级结构有关，没有复杂的二级结构，相对比较容易预测。MHCⅡ类分子呈递的分子在11～25个氨基酸，变化较大，主要由CD4 T辅助细胞识别。EpiMatrix和Conservatrix等生物信息学分析工具可以用来分析MHC限制性的T细胞表位，并且可以确定那些同一病原体不同菌株问保守的表位。已有的结果表明，这些工具可以较好地筛选CTL的结合表位，这对加快抗原筛选和疫苗研究具有重要意义。

五、结核杆菌新型抗原筛选

为了更加形象地说明基因组学、蛋白质组学在疫苗研究中的重要作用，以肺结核疫苗研究为例加以说明。肺结核是目前仅次于HIV的严重的传染．病，耐药性增多以及合并HIV感染使得治疗非常困难，并且缺乏有效的疫苗保护。传统BCG疫苗的保护效率受到质疑，开发新型的结核疫苗刻不容缓。结核杆菌感染机体后，寄生于巨噬细胞内，细胞免疫是抗结核的主要保护性免疫反应，包括CD4 T细胞介导的Thl型免疫反应和CD8 细胞介导的细胞毒性免疫反应。传统上对结核保护性抗原的筛选主要依靠对培养滤液蛋白和膜蛋白的分离、纯化，尽管找到了一些具有保护作用的抗原，但是很有限。随着人型结核杆菌基因组及牛型结核杆菌基因组卡介苗基因组测序的完成，科学工作者设想综合利用基因组学、比较基因组学和蛋白质组学等知识筛选新的保护性抗原，加快疫苗的研究步伐(图2)。首先利用生物信息学分析，研究人员可以将蛋白质分为分泌蛋白、膜结合蛋白以及一些蛋白家族(如ESAT一6蛋白家族、PE和PPE家族)|1 ，其中ESAT6家族没有信号肽序列，但为分泌性蛋白，大多是一些重要的保护性抗原物质。PE和PPE家族大约占结核杆菌编码蛋白的9％ ，特点是抗原变异性大，可能与免疫逃逸有关。其次通过比较基因组学和蛋白质组学的研究，对BCG缺失的蛋白质组和感染状态下诱导表达的蛋白质组加以分析。BCG的免疫保护力不理想，因此BCG缺失的基因有可能是具有免疫保护性的抗原。分子生物学已经揭示BCG缺失16个DNA片段(RD1～16)，含129个基因。其中RD1区与毒力关系密切，该区编码的ESAT6、CFP10和TB37．6被发现可以诱导强的T细胞免疫反应。此外，在不同环境中蛋白质表达有一定的不同，感染状态胥白质组学的研究将为结核疫苗保护性抗原的筛选提供新的思路。经上述分析筛选到一些新的基因，进一步应用一些计算机分析工具(如EpiMatrix)分析蛋白质中可以与MHC结合的T细胞表位，最后将经过上述途径筛选到的蛋白质分子克隆表达，再应用PPD阳性病人的外周血细胞筛选可以被T细胞识别的抗原，最终筛选到候选疫苗抗原，用于动物学实验研究 。结核杆菌毒力基因的鉴定比较复杂，除了上面提到的通过分子杂交和蛋白质组学进行筛选外，还可以通过使毒力株基因失活，或使非毒力株基因互补构建结核杆菌突变株，观察突变的结核杆菌感染动物后动物的死亡率和细菌存活数来筛选毒力基因。

六、展望

尽管抗生素的研究开发对抑制微生物感染起了很大的作用，但是抗生素耐药的问题越来越突出，使得药物治疗遇到了很大的困难。微生物和寄生虫感染的最终解决需要疫苗的研究。以基因组学、蛋白质组学为基础的高通量疫苗抗原筛选技术将促进疫苗研究快速发展，是对疫苗研究的革命性贡献，疫苗研究将进人一个新的时代。抗原组学不仅为疫苗的发展奠定了基础，也为鉴定新型抗微生物化合物(如单克隆抗体、抗生素、小分子药物)以干扰病原体的感染，提供了新的途径。此外，一些突发的新的致病微生物的流行会对公共卫生和安全产生很大的威胁，如2003年严重急性呼吸综合征(SARS)的发病与流行。如何在尽可能短的时问内研制成功疫苗对于控制传染病的流行和蔓延，维护社会的稳定具有重要的意义。科学工作者还需要进一步发展新的方法来加快疫苗的研究，缩短研制周期，以使疫苗更好地为社会服务。

省略了原文中图（照）片及部分内容，如对本文感兴趣，请参阅国外医学·微生物学分册  2005年28卷第4期