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努力提高我国病毒性肝炎的实验室诊断水平

李兰娟

来源：检验医学专题网      摘自 中华检验医学杂志     加入时间：2008-04-04

乙型肝炎是当前和今后相当长时期内严重危害我国人民健康的重要公共卫生问题，也是我国在建立以人为本的和谐社会过程中，需要迫切、优先解决的重大健康问题之一。我国也是丙型肝炎高流行区，HCV感染者约4 000万例，其中相当一部分患者同时感染HBV和(或)HIV。丙型肝炎发病隐匿、慢性化，较HBV感染更易发展为肝硬化和肝癌。由于目前丙型肝炎尚无疫苗可供预防，加之近年来我国人群中静脉内滥用毒品、人群流动性加大、器官移植和介入性检查及治疗等机会增多，我国丙型肝炎病毒感染呈上升趋势。因此，病毒性肝炎的防治形势十分严峻，是一项长期、艰苦而又具有重大挑战意义的工作。作为传染性疾病，实验室诊断水平对于病毒性肝炎的预防、诊断和治疗具有不可替代的关键作用。高灵敏度、高通量的快速筛查技术，有利于及时发现传染源、切断传播途径，促进预防和控制蔓延。高特异性、高灵敏度、早期的病原学检测试验，是做到病毒性肝炎早诊断、早治疗的依据和前提。而面对林林总总、良莠不齐的治疗药物、手段和方法，与疗效密切相关、可靠、明确的实验室指标是评判治疗效果和预后的重要客观依据。经过多年努力，我国在病毒性肝炎的预防、诊断、治疗以及发病机制研究方面已取得瞩目成就，国家提出再经过20年左右时间的努力，实现我国一般人群的HBsAg携带率降至中等发达国家3％-5％ 的水平、15岁以下儿童的携带率降至发达国家1％ 以下水平。进一步提高病毒性肝炎的诊治水平，降低肝硬化、肝衰竭、肝癌的发病率和病死率。要达到上述目标，需要解决一系列关键的科学问题和技术问题，其中，病毒性肝炎实验室诊断水平的提高至关重要。目前，我国病毒性肝炎实验诊断尚有许多问题亟待解决，涉及研发、应用和管理等多方面。

一、优化常规实验室诊断技术，推进与国际接轨

以提高病原检测灵敏度为首要目标，改进病毒性肝炎实验室诊断质量。虽然近年来我国病毒性肝炎诊断试剂的品种增加很快，质量也在逐步提高，但在检测灵敏度、特异性和重复性等方面，与国外同类试剂相比仍有一定差距。调查资料证实，国产HBsAg试剂与美国Abbott试剂比较，检测灵敏度约差10倍，不利于低水平HBsAg人群的筛查。陈瑜等 采用Abbott的微粒子酶免疫技术(MEIA)检测8 089名体检人群发现低浓度血清HBsAg人群占有不小比例(5μg/L以下者占总人群的2．34％ ，占HBsAg阳性人群的23．16％)，因我国HBV感染者众多，故此类低水平HBsAg人群不容忽视。如果漏检，可能导致HBV通过手术、输血等途径发生传播等严重后果。目前国内对病毒性肝炎血清标志物的检测主要技术仍是微板ELISA，国产商品化试剂盒已有20年的生产历程，然而总体质量仍不尽人意。已有厂家研发并推出新型的免疫发光技术，但性能尚未得到广泛评价。HBV核酸定量试剂盒也存在类似的问题，美国FDA评判此类试剂是否能用于血液筛检的标准之一是必须对50 copies/ml含量的病毒核酸检出率>95％ ，而目前国产HBV DNA荧光定量PCR检测试剂灵敏度只能达到10³-10⁴ copies/ml，相差20倍以上，难以检出低病毒载量的患者。而国外多项报告证实在单一抗HBc阳性人群中，约14％可检到10² copies/ml左右的低浓度HBV DNA。李金明等调查报告显示弱阳性质控血清HBV DNA含量低于5×10⁵ copies／ml时大部分实验室(56％)测不出。国内已有机构研发低拷贝的HBV DNA检测技术，但未见推广和产业化。进一步加强病毒性肝炎检测技术的标准化。资料显示，采用不同检测技术或不同厂家试剂盒检测同一人群的病毒性肝炎标志物结果一致性方面仍有待提高，Chen等 对三种具有代表性的自动化免疫分析仪检测血清乙肝标志物结果比对发现，HBsAg和HBeAg检测结果符合率高，而抗HBc、抗HBe和抗HBs结果符合率相对较低。国产试剂检测结果的可比性问题更为突出。试剂盒的参照体系、生产流程、实验室人员操作和报告方式等都存在标准化问题。例如，如何做到洗板机、酶标仪的规范使用，正确的维护保养，检测结果报告的客观性等。尽管要求使用酶标仪报告结果，但由于很多仪器缺乏合理的维护保养，没有得到很好使用，影响结果的准确性。部分实验室依据肉眼观察结果，主观性大，且难以报告低浓度结果以及抗原抗体转换时期共存结果。病毒性肝炎标志物检测技术的发展趋势是从定性检测转变为定量分析，国际上已有HBsAg定量检测试剂盒并正在得到推广，对于早期发现血清学转换、判断抗病毒疗效具有重要意义。改善病毒性肝炎实验室检测技术和质量，提高灵敏度和重复性，主要依靠研发机构、厂家的投入和努力，国家应给予积极扶持和正确引导，推进行业标准化建设，使我国在该领域技术迅速接近国际水平。

二、注重创新，发展新技术，提高病原学检测水平

(一)病毒性肝炎的基因分型检测技术

根据HBV病毒的基因序列的异质性>8％标准，可将其分为8型，分别为A、B、C、D、E、F、G、H。HBV基因型分布具有地区差异，而且与HBeAg血清转换率、病情严重程度、临床预后和抗病毒疗效等有一定的关系，因此HBV基因型的研究对于HBV感染的有效防治具有重要意义。当前HBV分型技术主要采用基因分型和血清学分型等方法。HBV基因分型有：全基因测序、多重PCR、探针杂交技术、限制性片段长度多态性分析技术等。HBV全基因测序分型结果准确性高，尤其是能够发现两种不同基因型的重组体(recombination)感染，被公认为HBV基因分型的金标准，但比较昂贵繁琐，不适合常规应用。多重PCR技术采用针对HBV不同基因型的特异性引物，结合实时荧光定量PCR技术，能够快速进行HBV基因分型，且具有很高灵敏度，具有推广应用前景。目前主要是针对B、C基因型，如能进一步达到对多个基因型一步反应就能获得结果，将会给临床带来更多帮助。基因型特异探针(genotype—specific probe assay，GSPA)试剂盒鉴定A—G基因型：HBV的前s1区域相关序列用生物素标记的引物作PCR扩增后，扩增产物与微量反应孔中包被的针对某一基因型的互补序列杂交结合，并比色测定，该方法已有商品化供应。血清学分型方法主要采用ELISA方法检测HBV基因型。根据HBV前s2区产物存在b、k、m、s、u、f和g等7种表位，用酶标记单克

隆抗体检测相应表位，根据表位组合的不同进行基因分型。ELISA简单快速，适合临床实验室常规应用与大规模筛选。但ELISA对不同基因型的HBV重组体感染以及由基因点突变引起的HBsAg表位变异不能检HCV也存在不同基因型，且分布有地域特性。公认的HCV基因型有6个型和50多个亚型 。我国HCV基因型主要以lb、2a型为主。HCV基因型与α干扰素的疗效及临床转归密切相关。目前HCV基因分型主要采用对HCV RNA进行核苷酸序列分析、特异性探针杂交技术等，但技术要求高，操作复杂，不易常规开展。HCV血清学分型技术是根据HCV某些区域表达抗原具有与基因型对应的型别差异，合成型特异性多肽作为包被抗原，对HCV血清抗体进行分型检测。陈瑜等 采用Mumx HCV血清分型试验结果显示，HCV血清型与基因型之间有很高的符合率(96．8％)。HCV血清分型以1型为主(占78．9％)，对应的基因型以lb型为主(占78．3％)，la型仅占21．7％ 。血清分型为2型的占19．2％ ，对应的基因型均为2a型。血清分型为混合型(1+2型)1例，占1．9％ ，基因分型为lb型。1b型与非1b型对干扰素的应答率和长期有效性具有显著性差异，1b型HCV对IFN．Of．治疗的持续有效率最低。血清分型试验虽不能区分亚型，但对基因lb型的间接推断有一定的可信度，对干扰素治疗的病例选择及疗效判定具有一定的参考价值。血清分型方法简便易行、适合推广，且对因各种原因引起的HCV RNA阴性而抗HCV抗体阳性的丙型肝炎患者血清标本也可进行分型。

(二)新型的联合检测技术在病毒性肝炎诊断中的应用

主要有核酸联合检测和抗原抗体联合检测。包括HBV、HCV、HIV等多项病毒核酸联合检测技术已应用于血液筛查中，如Roche COBAS Ampli Screen HBV/HCV/HIV检测系统，能够达到很高的灵敏度，减少常规酶联免疫检测“窗口期”所致的漏检，提高血液安全。但目前检测成本较高，对于发展中国家普遍开展还不现实。

病毒基因重要变异位点的联合检测。HBV、HCV等都是变异频率很高的病毒，某些变异具有重要的临床意义，与肝炎的慢性化、重症化等有关，如HBV前C区第l896G A，HBV CP区的l764 A T，1766 GA，1762 A T，PreS2起始密码子变异(ATG ACT，ATG ATA)等，变异多成簇出现。HBV耐药变异的快速联合检测对于指导抗病毒治疗具有重要价值。HBV对拉米夫定等核苷类似物的耐药突变发生在HBV的P基因区。HBV对拉米夫定耐药主要是与DNA聚合酶结合位点的YMDD(rtm204I/V)变异所致，也发现常常伴有附近区域其他位点的变异(rtLl80M、rtV173L等)。新近陆续发现了其他核苷类似物耐药相关的变异，如针对阿德福韦(ADV)耐药：rtA181V、rtN236T；恩替卡韦(ECV)耐药：rtT184A、rtM250V。还存在对核苷类似物的交叉耐药，如拉米夫定耐药相关的变异rtM204I/V、rtL180M、rtV173L可能与恩曲他滨(Frc)、特比夫定(LiT)耐药相关。HBV的P基因区核苷类似物的耐药突变常常多位点聚集出现，并可能体现交叉耐药性。针对核苷类似物的HBV P区耐药突变检测技术可分为定性和定量检测二大类。定性检测技术除了经典的DNA测序外，还有PCR限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)技术、巢式PCR技术、肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)介导的PCR钳夹技术、线性探针(INNO—LiPA HBV DR Line Probe，LiPA)技术等；定量分析技术如：实时荧光PCR技术、扩增阻碍突变系统聚合酶链反应(amplification refractory mutation system PCR，ARMS PCR)技术、基因微阵列技术等。目前的研发趋势是研制能够快速、定量、多位点联合检测、成本低廉、易于推广的新技术。Sun等 设计HBV序列特异的锁核酸(1ocked nucleic acid，LNA)探针构建多重实时PCR对rtM204I/V、rtL180M、rtV173L联合检测，获得在10 copies/ml HBV DNA可以检出1％ 的变异株。HCV抗原/抗体联合检测技术(HCV As/Ab)。HCV抗体检测已广泛应用于HCV感染诊断和献血员筛查。在急性HCV感染患者，从HCV感染至抗体检出的“窗口期”为3～8周。HCV抗体ELISA检测方法从1989年建立以来发展至第三代检测试剂，检测窗口期从82天缩短到了66天。采用核酸检测方法测定HCVRNA或采用酶免疫分析方法检测HCV核心抗原有利于HCV感染早期诊断。近期推出的HCV Ag/Ab联合检测试剂可同时检测血清HCV抗原和抗体，能进一步缩短HCV感染的检测窗口期，尤其是在免疫功能缺陷缺乏抗体应答的患者可显著提高HCV感染的检出率，在不具备核酸检测设备和技术的地区更有实用价值。HCV A s/Ab联合检测试剂在检测孔中同时包被了针对HCV核心抗原的单克隆抗体和纯化的NS3、NS4区重组蛋白及核心区多肽，血清样本中的HCV抗原或抗体可与之特异性地结合，通过ELISA原理测定结果。对HCV As/Ab联合检测试剂评价结果显示，HCV As/Ab联合检测阳性结果较检出HCV RNA迟5．1 d，较单一HCV抗体检出提前26．8 d。在HIV感染患者中，HCV As/Ab联合检测检出HCV感染较HCV抗体检出提前50 d。Ansaldi等对包括HCV不同基因型感染、HBV/HCV、HIV/HCV共同感染以及HCV抗体低浓度患者等7个HCV感染的不同人群进行检测，HCV Ag/Ab联合检测的灵敏度为82．4％～100％不等，特异度为99．8％ 。

(三)病毒特异的细胞免疫检测技术在病毒性肝炎诊断中的应用

针对HBV、HCV等病毒抗原的特异性T淋巴细胞(virus antigen specific T lymphocyte)在清除病毒中发挥主要作用，其水平和功能状况与肝炎的转归及抗病毒疗效密切相关。对病毒抗原特异性T细胞应答功能检测的新技术有：MHC肽四聚体(Tetramer)流式细胞技术测定特异性T细胞数量，酶联免疫吸附斑点 试验(ELISPOT)测定特异性T细胞表达细胞因子功能，CytoTox96非放射性细胞毒试验技术测定杀伤靶细胞能力等。Tetramer是由大肠杆菌重组表达并重新折叠形成的MHC I类分子胞外段(包括重链和p2微球蛋白)，其抗原槽结合病毒抗原的表位短肽(长度在1O个氨基酸左右)，重链末端经生物素化后与链霉亲和素4：1组成的MHC肽四聚体。Tetramer流式细胞技术的基本原理为：Tetramer用藻红蛋白(PE)标记，外周血中针对某一表位的特异性CDs+T细胞通过T细胞受体(TCR)与抗原槽中短肽识别、结合，荧光色素(FITC)标记的anti—CDs+检测CDs+T细胞，通过双色标记流式细胞技术检测HBV抗原特异性CD；T细胞。Tetramer流式细胞技术是一种能直接检测(ex vivo)外周血或者肝组织内特异性CD；T细胞数量的新技术，避免了体外培养技术存在的诸多外界条件影响因素，更真实地反映了体内特异性CDs+T细胞的实际情况。目前最常见的是采用HLA—A2分子与HBV肽段合成的Tetramer检测受HLA—A2限制的针对HBV三个重要表位肽段core18-27、polymerase575-583和envelope335-343的特异性CDs+T细胞。ELISPOT采用经特异性病毒抗原肽段(如HBV core 18-27)诱导的培养PBMC，如其中的特异性T细胞表达IFN- ，被试验孔内包被的IFN-抗体捕获，再与加入的酶标记IFN-γ 抗体以“夹心”方式结合，加入底物显色，产生有色斑点，其数量代表了病毒特异性T细胞表达IFN一 的水平。Boni等H 对慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定治疗期间，HBV DNA和HbeAg均不同程度下降，测定外周血HBV特异性CDs+T数量和功能，较治疗前均明显增多和增强，且与HBV DNA下降同步。治疗中还发现特异性cD T淋巴细胞应答功能改善，且与病毒血症减轻相伴随，提示经拉米夫定治疗后，HBV特异性CDs+CTL的应答增强与患者体内病毒抗原负荷减轻和cD 细胞功能改善有关。Tsai等H 对分别接受INF一仅、胸腺肽一仅和拉米夫定治疗的慢性乙型肝炎患者研究发现，经治疗3个月后，显效组的外周血特异性CDs+T数量、靶细胞杀伤能力以及表达INF一 的能力显著高于部分显效组和未显效组。陈瑜等发现外周血HBV特异性CD8⁺T应答功能与肝炎不同转归相关。近期发现CD8+、CD25+去调节性T细胞(Treg)可能通过下调抗病毒免疫应答而与HBV感染慢性化有关，缺失Treg细胞的慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞的增殖能力以及分泌INF一 能力增强。在急性及慢性感染HBV个体中，Treg细胞可以有效抑制细胞毒CD；T细胞的活性；Xu等发现在慢性乙型肝炎患者外周血中Treg细胞水平明显升高，且与病毒载量正相关。上述细胞免疫指标有可能成为一类新型的病毒性肝炎诊断、疗效评价和预测指标。

(四)蛋白组学、代谢组学相关技术在病毒性肝炎诊断中的应用蛋白组学、代谢组学等新型技术应用于病毒性肝炎的诊断、疗效评判等的报道逐渐增多，并预示了很好的应用前景。病毒性肝炎必然引起血清蛋白质的变化，且蛋白质的质和量与病情的严重程度相关，已有少数蛋白质如凝血因子作为判断肝炎严重程度的指标而应用于临床。蛋白质组学技术能对生物样品中大量蛋白质做全景式的检测和分析，从而极大地提高了利用蛋白质的改变作为诊断、预测疾病依据的可能性。Pooh等l17 采用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI—TOF MS)技术对慢性乙型肝炎患者的血清进行了蛋白质指纹分析，结果表明，有3O个蛋白质峰与肝纤维化程度密切相关，根据这些峰建立的人工神经网络诊断模型，能够有效地预测慢性乙型肝炎患者的纤维化或肝硬化程度。Schwegler等H 应用金属亲和芯片，对无肝硬化的丙型肝炎患者、丙型肝炎肝硬化患者和丙型肝炎相关的肝细胞癌患者的蛋白质指纹图谱进行了研究，用所获得的M／Z为5 808、8 939、9 501、11 735等38个差异表达的小分子蛋白质生成分类树，结果表明这种分类树能对慢性丙型肝炎、丙型肝炎肝硬化、丙型肝炎相关的肝细胞癌进行两两区别，预测的敏感度／特异度达74％ ～95％ 。最近，Yang等采用以高通量液相色谱一质谱(HPLC—Ms)为核心的代谢组学(Metobonomics)技术平台对37例急性肝衰竭患者血清分析发现了5个新的与肝衰竭相关的潜在生物标志: 溶血磷脂胆碱(LPC)C18：0、LPC C16：0、LPC C18：l、LPC C18：2和GCDCA，这些指标与肝脏代谢有关，参与胆汁代谢、炎症反应等，有可能成为新的反映肝脏功能的指标而应用于临床。

三、紧密结合临床，按照循证医学要求不断提高实验室数据的利用效率和价值

改善病毒性肝炎实验诊断水平依赖于实验室和临床的密切合作。实验室的大量数据如何得到有效利用，如何实现与其他临床资料的有机整合，如何及时了解并不断满足临床对实验室诊断的需求，是实验室和临床共同面临的、需要共同解决的重大问题。循证医学不仅要求实验室提供尽可能好的检验结果，而且要求临床合理地利用实验室资源。我国虽然在病毒性肝炎的预防、诊断和治疗中积累了诸多经验，但与国际水平比较，差异不仅仅在检测技术上，而更为突出的在于临床资料、实验室数据等的管理和利用上，缺少符合循证医学原则的系统、随机、对照、长期的随访资料，缺少对病毒性肝炎，尤其是慢性乙型、丙型肝炎的自然史研究，影响了防治水平的提高。解决问题需要推进二个方面的工作：一是病毒性肝炎临床信息平台建设，二是病毒性肝炎生物样本库建设。充分运用当今信息技术手段，采用新型数据库和数据挖掘技术等，对病毒性肝炎患者的临床症状、实验室检验、辅助检查、治疗信息以及个人心理、生理、生活习惯等相关资料进行筛选、整合、提炼，构建诊疗信息库，并能实现不同数据库信息共享。有条件的实验室应考虑建立大样本的病毒性肝炎生物样品库及样本信息数据库，包括详细的临床信息、标本状况、己检测试验数据结果以及对生物样品的全程管理。

省略了原文中的图表，如对本文感兴趣，请参阅中华检验医学杂志2007年30卷8期。