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肿瘤中的miroRNA标志

George A. Calin 和 Carlo M. Croce

Nature Reviews, CANCER, volume 6, Nnovember 2006 

癌症是一种复杂的遗传疾病，涉及到编码和非编码基因在结构和表达水平上的异常。在过去三十年中，编码蛋白的癌基因和抑癌基因^1-3被认为是肿瘤发生的原因。然而，在刚刚过去的几年间，发现了数千个新基因，它们没有明显的开放阅读框，与非编码RNA（ncRNA）转录本对应。因此，肿瘤细胞基因组的复杂性远远超出人们之前的预期。非编码cDNA常常有几千或几万个碱基，由于实验技术的限制，目前很难克隆，因此，对于长片段的ncRNA的研究进展缓慢⁴，但是，对于ncRNA家族的短片段成员的研究，最近取得了巨大的成功^5-9。

这些microRNA(miRNAs)是小的非编码RNA，长度为20-22bp，通常是从60-110个核酸的发夹结构RNA前体剪接得到^10-12。miRNAs的生物合成需要复杂的蛋白体系，包括Argonaute家族成员，依赖于POl II的转录机制，RNase III Drosha和Dicer¹³。miRNAs参与的重要生物学过程，包括发育，分化，调亡和增殖^11-14，通过与靶mRNA非完全互补，在转录或转录后水平调控编码蛋白的基因的表达^15-17。目前已报导的人miRNA（Sanger Institution于2006年7月发布）超过450个，是最初推算数量的2倍多¹⁹，还有超过1000个预测的miRNA基因^20-22需要通过实验验证。

最初对miRNA表达变化的探讨来自于对B细胞慢性淋巴性白血病（CLL）的研究²³，其后，众多研究小组在多种人类肿瘤中检测到miRNA的表达变化（文献24-34对癌症与miRNA的关联进行了探讨）。研究发现，miRNA既能起到癌基因的作用（如mir-155和mir-17-92簇），也能起到抑癌基因的作用（如mir-15a和mir-16-1），因此，miRNAs对肿瘤的发生发展有重要作用。对可能影响miRNAs表达的基因组水平异常的研究，得到了与编码蛋白的基因一致的结果，这些异常包括染色质重排，基因组扩增，缺失和突变。在特定种类的肿瘤中，蛋白编码基因和miRNA水平的异常都能被检测到²⁹。编码miRNA的基因中，纯合突变或者同时发生突变和缺失的情形很少发生³⁵，而肿瘤中发现的杂合子序列变异究竟有何意义，目前尚不清楚³⁶。此外，目前正开展的研究还包括，靶mRNA互补序列多态性在肿瘤病人³⁷，或者其他遗传疾病易感个体³⁸中的作用，。目前的研究结果表明，肿瘤中，影响microRNA功能的主要机制是基因表达异常，表现为与正常组织相比，miRNA成熟体或前体序列的表达异常。

        肿瘤和正常组织的miRNA表达谱

miRNA的寡核苷酸芯片是目前研究大量样本中数百种miRNA的肿瘤特异性表达的最常用的高通量方法（综述13，39，40）。以微阵列芯片为基础的miRNA芯片最早由Liu等开发。目前，世界上最为成熟的miRNA芯片是丹麦Exiqon开发的miRCURY™ LNA 芯片。该芯片已经推出8.1版，可以检测Sanger miRBase数据库8.1版中所有物种的全部microRNA。其中人的microRNA检测范围更达到Sanger miRBase数据库8.2版水平。此外，芯片中还加入近150个miRPlus™ 探针，能揭示数据库中尚未提供的microRNA信息。芯片采用LNA（locked nucleic acid）专利技术，极大的增进了捕获探针与互补的靶DNA或RNA的亲和活力，使芯片具有高灵敏度，高特异性等特点。另一种用于研究miRNA表达水平的方法是结合磁珠与FCM（流式细胞仪）的方法⁴¹（图1）。其他技术发展还包括针对miRNA前体⁴²或成熟体的实时定量PCR^43-44，miRAGE——采用基因表达系列分析（SAGE）法⁴⁵在基因组范围内分析miRNA，或者是基于高通量芯片的Klenow酶检测法（RAKE）⁴⁶。这些方法各有优劣，但是，在近年中，采用这些方法研究了超过1000种原发瘤，肿瘤中miRNA受到的抑制调控的趋势渐渐显现出来。

图1 用于分析miRNA表达水平的芯片和基于磁珠的FCM方法

miRNA表达谱可以对人类肿瘤分型

到目前为止，在被研究的每种肿瘤中，miRNA表达水平（包括前体/成熟miRNA）与相应组织的正常细胞中的表达水平都有显著区别（表1，图2）。现在，已经有采用两种截然不同的方法对不同肿瘤的全基因组miRNA表达水平进行大规模研究的结果发表^41-47。

Lu等开发出一套特异性很高的基于磁珠的FCM方法，系统的研究了334例白血病和实体瘤，发现miRNA表达谱与谱系和分化阶段有关。进一步研究发现，每种肿瘤的基因表达谱反映了转化的不同机制。例如，急性白血病可分为三种，分别为BCR-ABL，TEL-AML1（急性粒细胞白血病1，或者是Runt相关转录因子1；RUNX1）和MLL（混合谱系白血病）重排，等等。一项有趣的发现是，肿瘤的miRNA表达水平普遍低于正常组织，在217个被检测的miRNA中，有129表现出这种表达模式。对此的一种解释是，miRNA的整体表达水平反映了细胞的分化阶段。实际上，包括Lu等和Garzon等的众多研究表明：不同的miRNA表达水平反映了造血细胞的不同分化水平。

表1 肿瘤中miRNA表达水平的部分研究成果

*表格中只包括了对人原发瘤的芯片分析结果

Violinia等采用芯片分析了540个样本，包括来源于人类最常见的6种实质瘤的363个样本和177个正常组织，发现与正常细胞相比，肿瘤细胞的miRNA具有特定的表达谱⁴⁷（图2）。在所分析的228个miRNA基因中，肿瘤细胞中有36个过表达，21个表达下调。分层聚类分析显示，根据miRNA标记，肿瘤组织能够根据其组织来源进行分类。除上述实验之外，针对不同的肿瘤进行的基因组水平研究还包括CLL⁴⁹，乳腺癌⁵⁰，胶质母细胞瘤⁵¹，甲状腺乳头状癌³⁷，肝细胞癌⁵²，肺癌⁵³，结肠癌⁴⁵和胰腺内分泌癌⁵⁴。例如，通过比较104组配对的原发肺癌和正常肺组织，Yanaihara等发现43个表达有明显差异的miRNA，在肿瘤中下调的miRNA有28个，上调的有15个。Murakami等采用芯片平台对肝细胞癌进行研究，发现了8种表达有差异的miRNA，其中5种表达下调⁵²。所有这些研究都支持同一种结论，即癌细胞的miRNA表达变化既有上调，也有下调。

图2 人实体瘤和体液瘤miRNA表达分析的实例

在研究miRNA表达变化时，一个关键的因素是表达变化达到何种程度才被认为差异具有生物学意义。在甲状腺乳头状癌中，10-20倍的表达差异被认为是重要的³⁷。但是，有时候，差异小一些的表达变化也被认为是显著地（例如小于2倍的差异）^{35, 49-51}。这是由于肿瘤中大量的miRNA表达出现差异，可能是特异的miRNA可以调控多种靶基因表达。据此可以推测，可能同时出现2个或多个协同作用的癌基因或抑癌基因表达受到抑制的情形²⁹。与之相反的观点则认为，某些情况下发现的肿瘤和正常细胞之间的表达差异在生物学上可能是无关的变化：不同靶点间的综合作用结果可能是拮抗效应而不是累积效应（例如，对凋亡促进基因和凋亡抑制基因的抑制均发生）。

在不同肿瘤中， miRNA差异表达普遍存在，提示可能是一些共同的生物学通路受到调控。

通过两种统计学方法对芯片数据进行分析，这两种方法分别是微矩阵显著性分析SAM和微矩阵预测性分析PAM，共研究了6种实体瘤（肺癌，乳腺癌，结肠癌，胃癌，前列腺癌和胰腺癌）的miRNA表达。Violinia等的实验结果说明，存在一种包含21种miRNA的表达差异⁴⁷的miRNA标记，其中的miRNA在至少3种不同类型的肿瘤中表达有差异。最明显的是miR-21，在6种肿瘤中均为过表达，miR-17-5p和miR-191在5种肿瘤中均为过表达。由于所研究的肿瘤的胚胎来源各不相同，这些发现的意义在于，这些miRNA参与了基本的信号通路，而这些信号通路在多种肿瘤中均发生变化。对于有明显表达差异的miRNA，预测得到的靶基因明显集中于已知的抑癌基因和癌基因⁴⁷, 进一步证实了在肿瘤发生过程中，这些miRNA有重要作用。根据 Meng等的研究，miR-21，唯一一个在6种肿瘤中均过表达的miRNA，在恶性神经胶母细胞瘤^{55, 51}和胆管癌⁵⁶中同样过表达，并且在胆管癌细胞中，miR-21的直接靶点是抑癌基因PTEN。PTEN编码一种磷酸酶，抑制细胞生长或者细胞存活的信号通路。在多种肿瘤的晚期，包括乳腺癌，肺癌，胃癌和前列腺，PTEN的功能发生改变⁵⁷。在所有这些肿瘤中，PTEN位点的杂合子缺失（LOH）很少发生，其频率<10%，那么，推测若在其他类型的肿瘤中也发现PTEN是miR-21的靶点，那么很有可能miRNA调控是造成PTEN失活的主要机制。此外，在培养的胶质母细胞瘤细胞中，使miR-21表达下调，激活了依赖于caspase的细胞凋亡途径⁵⁵。所有这些研究显示，miR-21是抑制凋亡和促进细胞存活的因子。

F. Slack的实验室进行了一系列精彩的实验，深入研究了一些miRNA，这些miRNA在肿瘤中下调，并且靶位点是抑癌基因或癌基因。结果显示，Ras癌基因受到let-7 miRNA家族的调控⁵⁸。Voorhoeve等同样在深入阐明miRNA功能方面做了出色的工作，其研究小组发现，在青少年和成年的睾丸生殖细胞癌中，miR-372和miR-373起到了癌基因的作用。在表达癌基因HRAS和功能性的野生型TP53⁵⁹的细胞中，这些miRNA能促进细胞增殖和转化。

从转基因和基因敲除的小鼠模型中，同样得到了人类肿瘤中miRNA功能的证据。这对于研究表达下调的miRNA所参与的肿瘤形成途径极为重要。He等的研究表明，miR-17-92簇的增强型表达加速了MYC介导的淋巴瘤发生，说明在B细胞淋巴瘤中，由于基因组扩增而过表达的miRNA中，有部分可能是具有癌基因潜能。最近，Costinean等建立了第一只能够特异性在B细胞中过表达miR-155基因⁶¹的转基因小鼠。这个基因在多种恶性B细胞^62-64中均过表达。转基因小鼠首先发生多克隆性前淋巴细胞和前B细胞增殖，随后则发生B细胞恶质化。根据结果推测，miR-155表达受到抑制是肿瘤发生的早期事件，若要发展出完全的肿瘤表型，还需要一系列后继的基因变化⁶¹。与之类似的还有对MYC癌基因的研究结果。MYC的激活是通过人B细胞瘤中染色体易位产生的⁶⁵。在一种鸟类模型中，发生在淋巴瘤形成和红细胞白血病形成中的致癌协同作用，在非蛋白编码的BIC基因和MYC基因间被观察到，后来的研究发现，BIC基因区域包括了miR-155序列⁶⁶，说明MYC和BIC在肿瘤中可能存在协同作用。对于从miR-155转基因小鼠中分离出恶质化的B细胞，进行芯片分析，通过与未转基因小鼠的B细胞对照比较，筛选出表达受抑制的蛋白编码基因的完整列表，并且可以进一步筛选出miR-155直接和间接的靶基因。特别要指出的是，在转基因模型小鼠的前恶质化细胞中，有16种不同的miRNA表达出现差异，说明在蛋白编码基因和miRNA之间存在复杂的联系，可能影响特殊的信号传导途径，并且可能miR-155和其他表达下调的miRNA之间也存在直接或者间接的相互作用。

致癌-miRNA和抑癌-miRNA：对同一个基因的两种不同认识？

基因组水平的研究同样为研究miRNA在肿瘤中的作用提供了新的思路和观念。第一种思路来自于O’Donnell在细胞模型中的研究。在人B细胞株 P493-6中，MYC过表达，而miR-17-92座位的miRNAs有抑癌活性，它们的表达抑制了E2F1的表达，并进一步抑制了MYC介导的细胞增殖⁶⁷。然而，从B细胞淋巴瘤中得到的结论则有所不同。同样这一miRNAs簇，与MYC协同作用，并且抑制凋亡，因此又有潜在的癌基因功能， ⁶⁰。一种可能的解释是，同样的miRNA参与了不同的信号通路，在细胞存活，生长和增殖等方面，由于细胞种类和基因表达模式的差异而有不同的效应。miRNA和mRNA相互作用的联合机制意味着同一个miRNA可能有多个不同的靶基因，而在不同类型的细胞中，同一种mRNA也可能受到不同的miRNA的调控。例如，Cimmino等发现白血病细胞内，若13号染色体上miR-15a和miR-16-1座位缺失，此时导入外源性的miRNA，则会诱发凋亡。导入的外源性miR-15a和miR-16-1与凋亡抑制基因BCL2相互作用，但在miR-15a，miR-16-1和BCL2都正常表达的293胚肾细胞中则没有这种效应 ⁶⁸。可能是B细胞中miR-15a和miR-16-1的缺失诱导了BCL2的过表达，从而引发B细胞恶质化。如果换一种组织，miR-15a和miR-16-1的过表达可能会造成某种抑癌基因表达的缺失，而这种基因对于生长控制和细胞凋亡十分重要。有一些研究结果支持了这种假设，在CLL病人的B淋巴细胞中，虽然miR-15a和miR-16-1表达下调²³，但是，在神经外胚层来源的胰腺内分泌癌细胞中，同样的miRNA则为过表达^{47, 54}。

第二种观点源于以下的发现：在多种不同肿瘤中发现，前体miRNA持续性的异常表达，但是有活性的miRNA分子表达水平并没有相应的变化^{42, 47, 49, 52, 53}。Yanaihara 等在他们找到的43个miRNA标志中，发现7个miRNA前体在正常肺组织和肺癌组织中表达有差异。而Jiang等通过特异性针对前体miRNA的实时定量PCR发现，在32种肿瘤细胞系中，有9种miRNA前体的表达有显著差异⁶⁹。这些研究提示，miRNA的“非活性”成分可能在肿瘤的发生中有独立的但目前尚不清楚的重要作用。可能的相互作用分子是RNA结合蛋白（例如，异质性细胞核核糖蛋白，hnRNPs），一类在所有肿瘤中表达均有异常的蛋白⁷⁰。这些蛋白与RNA分子结合，调控其稳定性，因此，可能在多种miRNA前体中序列中存在hnRNA结合域。但是，目前尚没有直接证据证明其对miRNA前体的调控功能。

miRNA表达异常的原因

目前，对肿瘤细胞中广泛存在的miRNA表达变化只做了初步的研究，对不同肿瘤中miRNA的异常表达的研究汇总，将有助于在整体上阐明miRNA表达谱。目前，至少有3种不同的机制（可能相互独立，也可能共同作用）已经被发现。这些改变与特异性的miRNA基因异常表达相关，并可以部分解释这些表达变化。

MiRNA定位在肿瘤相关基因组区域（CAGRs）中

对miRNA家族成百上千个新成员的研究发现，其中半数以上的miRNA定位于已经证明在肿瘤中易发生改变的染色体区域内⁷¹。这些区域包括：最小杂合子缺失区域，通常认为抑癌基因定位在这些区域中；最小扩增区域，可能包含癌基因；常见的断裂位点，靠近或在可能的癌基因或抑癌基因范围内，以及脆性位点（FRA）。FRA是容易发生姐妹染色质交换，易位，缺失，扩增的位点，或者质粒DNA和肿瘤相关病毒易插入位点，例如，人乳头瘤病毒（HPV）。值得注意的是，miRNA位点与子宫内膜癌相关的致癌性HPV插入位置密切相关，据此推测人类基因组中病毒的插入可能会干扰ncRNAs的功能⁷¹。

图3 染色体水平上microRNA位点的改变

一些研究表明，这些计算机预测出的相关性对于miRNA的表达是十分重要的。Zhang等通过高分辨芯片兼容的基因组杂交（aCGH）方法，发现肿瘤基因组中miRNA位点变化的频率很高⁷²。并且所研究的miRNA中大约有75%在成熟的miRNA和DNA拷贝数之间存在相关性，更为重要的是，这一结果与Iorio等在乳腺癌基因组获得的数据是一致的（分别有81%存在miRNA的扩增和过表达的一致性，60%存在miRNA缺失与表达下调的一致性）⁵⁰。这种一致性其它的例子还包括，两个研究小组分别对13号染色体上的两个miRNA簇进行的独立研究结果（图3）。簇一为miR-15a-miR-16-1，定位在13q14.3，该区域在B细胞慢性淋巴细胞白血病和垂体腺瘤中缺失，通过northern blots检测发现在这两种肿瘤患者中多有miRNA的表达下调^{23, 73}。簇二为miR-17-92，定位在13q31，在B细胞淋巴瘤和肺癌中该区域发生扩增，He等通过芯片实验发现相应的miRNA表达上调⁵⁹，而Hayashita的研究小组和Tagawa与Seto则通过northern blots 在肺癌和恶性淋巴癌中检测到相应miRNA的表达上调^{74, 75}。

miRNA表达的表观遗传调控

DNA整体甲基化水平低，CpG岛过甲基化和组蛋白修饰缺失是细胞恶性转化的表观遗传标志⁷⁶。已有多个小组开始研究表观遗传改变是否会影响miRNA表达。Scott等对乳腺癌细胞的研究表明，抑制组蛋白的去乙酰化酶，随后miRNA水平迅速改变⁷⁷。Saito等则发现，用5-氮杂脱氧胞苷（5-AzaCdR）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制物4-苯丁酸（PBA）联合处理膀胱癌细胞，对miRNA的表达有显著影响⁷⁸。17个miRNA（芯片同时检测miRNA有313个）表达上调超过3倍，其中miR-127表达水平变化最大。这个miRNA定位在染色体14q32的一个CpG小岛中，该区域在血癌中多发生易位，在实体瘤中则发生杂合子缺失（LOH）⁷¹。此外，联合处理还造成miR-127的转录起始位点附近的DNA甲基化水平的降低和活性组蛋白标记的增加。研究者发现，miR-127在翻译水平上抑制锌指结构特异性的转录抑制基因BCL6⁷⁸的转录。因此，5-AzaCdR和PBA对肿瘤细胞的联合处理诱导了miR-127的表达，进而发挥肿瘤抗性作用，具体机制则是抑制抗细胞凋亡因子如BCL6的表达，进一步诱导细胞凋亡⁷⁸。

DNA去甲基化和组蛋白去乙酰化对miRNA表达的影响可能具有组织特异性。对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞进行去甲基化的处理或者结合HDAC抑制剂进行处理，对miRNA表达水平没有显著影响^{36, 53}。支持这一假设的理由还有，通过芯片分析，在正常肺细胞中未发现miR-127表达³⁹，在癌组织和正常肺组织中也没有明显的表达差异⁵³。

miRNA合成相关基因和蛋白的异常变化

miRNA生物合成所涉及的蛋白机制非常复杂。理论上，miRNA合成相关蛋白发生变化将对miRNA的表达有显著的影响³⁴。实际上，在原发肿瘤中，Drosha的失效与miRNA的表达下调相关⁷⁹。而Karube等对NSCLC病人的大规模研究中则发现，在部分肺癌中，是Dicer而不是Drosha的表达水平下调。这一发现与NSCLC患者手术后存活率下降和肿瘤低分化状态的结果一致，而后二者又与预后差联系^{80, 81}。同样，NSCLC患者存活率下降和miR-155和let-7表达水平间也存在相关性^{53, 82}。这些结果提示，患者的存活率低可能是miRNA生物合成和表达均发生异常的结果。条件型Dicer敲除的小鼠模型存在发育缺陷，包括肺上皮异常^{81, 83}，但是，还没有在肿瘤形成方面的报道。向裸鼠注射Dicer缺失的胚胎干细胞也没有成瘤⁸⁴。

编码小RNA合成的相关蛋白的基因若发生异常，其影响范围可能远远超出目前所发现的。最近，发现一类新的种系特异性小ncRNAs（26-31个核苷酸，命名为PIWI-interacting RNAs（piRNAs）），并发现它们能与睾丸特异性鼠PIWI蛋白直系同源物结合^85-89。尤其引人注意的是，人类的这一Argonaute蛋白亚类的同源蛋白，命名为HIWI，定位在染色体12q24.33，而这一区域与青少年和成年人的睾丸生殖细胞癌发展密切相关。此外，HIWI在大多数睾丸精原细胞瘤中均为过表达⁹⁰。胃癌的HIWI表达则与细胞增殖密切相关⁹¹。这些研究提示，piRNAs可能代表了肿瘤相关的小ncRNAs作用的另一种类型，特别是与PIWI过表达相关。

miRNA表达谱应用于临床

作为人类肿瘤信号通路积极的参与者，miRNAs对肿瘤的诊断和预后也有重要意义（表格1）。在前面所讨论的多篇文章中，在多种肿瘤中对这一点都有证明^{49, 50, 62}。但是，也有其它的研究表明，当活体组织切片无法判断肿瘤类型时，miRNA可以被用来诊断。

作为诊断工具的miRNA表达谱

原发瘤位置未知的转移瘤（CUP）是目前诊断结果中10种最常见的肿瘤类型之一，在人类恶性肿瘤中的比例达到3-5%⁹²。CUP病人出现多种转移（已经是癌症晚期），但是未发现原发瘤（也就是肿瘤发生的起始位点和转移起点）。Lu等的研究极大的推动了对这种奇特的肿瘤的诊断。分析了17种分化很差，没有明显的组织学特征的肿瘤，Lu等发现，为了对样本进行正确的分类，基于miRNA的分类方法比基于mRNA的分类方法更为有效⁴¹。这个发现激动人心，相比较于分析成千上万种mRNAs，只分析几百种miRNAs的表达能更有效的预测CUP。由于miRNA表达随着分化阶段发生改变，与作为对照的分化程度高的肿瘤相比，分化程度差的肿瘤，其miRNA表达水平整体偏低⁴¹。而分化程度差的肿瘤中miRNA表达水平整体降低可能就是通过miRNA表达水平可以有效诊断CUP的原因。

在西方社会，CLL是最常见的成人白血病之一^{93, 94}。通常，这种疾病会发展成为恶性淋巴瘤或白血病，包括Richter综合症⁹⁵。对于绝大部分CLL病例，预后相对较好，因此，只有在诊断中发现预后差的标记物才会开始进行治疗⁹⁶。这样的标记物极少，在已经发现的标记物中，包括70kDa的zeta链相关蛋白（ZAP70）的高表达和免疫球蛋白重链可变区的突变缺失（IgV_H）。通过对144个CLL患者的miRNA进行分析，一组特异性的13个miRNAs（共分析190个miRNA）可以做为标记，根据预后的好或坏，或者疾病恶化与否对病人进行区分³⁵。在预后好的病人中，miR-16-1和miR-15a表达水平低，与早期的报道一致，即基因组13q14.3位点缺失的部分包含了与疾病时期相关的基因⁹⁷。在预后差的病人中发现的表达下调基因，包括miR-29家族。这一结果可以由最近的发现解释，在疾病恶性期病人的CLL细胞中过表达的癌基因TCL1，是miR-29家族的靶基因（Y. Pekarsky，未发表数据）。这些试验结果提示了一种模型，存在两种CLL，它们的分子组成不同，并且临床特征相反：一种是染色体13q14.3缺失和miR-16-1和miR-15a表达量低型，预后良好，疾病进展缓慢；另一种是miR-29家族基因表达量低，TCL1蛋白表达量高型，疾病进展到恶性期，可能发展为Richter综合症。而CLL样本中BCL2总是过表达⁹⁹，提示miR-16-1和miR-15a可能还有其他靶基因，这些基因与疾病进展密切相关；而BCL2表达下调的其它机制（例如，在少数病例中存在的BCL2易位¹⁰⁰），以及其它与之相互作用的miRNA也可能参与其中。

作为预后工具的MiRNA表达谱

对全世界的男性癌症患者来说，致死率最高的是肺癌¹⁰¹。因此，发现新的预后标志物（即与疾病进展相关的标记）可以帮助对病人进行诊断，发现那些可以从高强度治疗中受益的患者。通过对104位美国肺癌患者的单变量分析，发现miR-155（高表达）和let-7a-2（低表达）的水平与病人的预后差相关；而多变量分析则表明，当考虑所有的临床变量时，miR-155的表达水平仍然与预后差相关⁵³。在另一项对143位日本肺癌病人的研究中，发现let-7表达下调与外科治疗后存活时间缩短密切相关⁸²。在以上两项研究中，2/3的病人是腺癌（NSCLC的一种）。通过多变量分析，let-7的低表达水平可以作为独立的预后标志进行疾病分期，并且与存活期显著缩短有关⁸²。在一项对29项研究Ras癌基因在NSCLC癌症病人存活中的作用的荟萃分析中，发现Ras过表达与存活期缩短有关¹⁰²。由于let-7对 Ras有负调控作用⁵⁸，以上结果说明，在let-7，Ras表达和肺癌病人生命期之间存在联系。

癌症治疗中miRNA的应用前景

miRNAs在癌症中的应用目前尚在研究中。其理论依据是miRNAs是天然的反义作用因子，能够调控与真核生物生存和增殖相关的多种基因表达。而且miRNA表达谱在用吉西他滨治疗的过程中会发生；体外试验则证明，调控部分miRNA（如miR-21过表达）能增进胆管癌细胞对化疗药物的敏感性⁵⁶。这些结果为将miRNA作为治疗靶点提供了试验基础。经过修饰的miRNA在体内的半衰期更长，功效更久，例如LNA修饰的寡核苷酸¹⁰³，抗miRNA寡核苷酸（AMOs）¹⁰⁴和反义miRNA（antagomirs）¹⁰⁶等是将基础研究的成果应用于临床治疗的起始步骤。未来，通过miRNA转基因和敲除进行的体内试验将为miRNA治疗的安全性和有效性提供有用信息。

肿瘤易感的新方式

从酵母到人的各个物种，基因表达水平都有自然的区别。这种特征又被称为“基因表达表型”，具有可遗传性，这一点在对人类进行的家族聚集性研究和对酵母中进行的单个种族隔离研究中都有发现^{106, 107}。Cheung等采用芯片研究人的成淋巴细胞，发现了一组在不同个体间表达有较大差异的基因¹⁰⁶。无关个体间的基因表达水平差异是同卵双胞胎的3-11倍，兄弟姐妹间的差异则为2-5倍。这些数据提示，个体间的基因组差异可能是造成部分基因表达表型差异的原因¹⁰⁶。根据miRNA发挥功能的机制，通常miRNA的靶基因是一组有重要功能的编码蛋白的基因，推测若miRNAs序列或表达的差异通过生殖细胞遗传， miRNA可能到影响癌基因或者抑癌基因的表达水平，因此，miRNA与肿瘤易感性相关（图4）。

肿瘤病人中有特殊的一类，他们多是家族成员，患上相同或不同的肿瘤，但是没有发现明显的孟德尔遗传学特征。这类家族易感性是一个很大的医学难题，而对易感基因的识别，可以为早期诊断和对肿瘤的预防提供依据。虽然经过重重努力，这一易感现象的机制仍然是一个谜。一个研究得比较清楚的例子是家族性CLL：在某些家系中，有两个或多个成员出现CLL，发现存在共济失调性毛细血管扩张突变（ATM）^{108, 109}或ARLTS1基因的突变¹¹⁰，也出现miR-15a和miR-16-1转录本的突变³⁵，但对其他病例，真正的易感基因仍然是未知的。

在美国，非洲裔前列腺癌患者的比例与白种人患该病的比例不一致，遗传背景可能是一个重要的影响因素，但是经过了几十年的研究，仍然没有确定具体的靶基因¹¹¹。一项研究分析来源于两个不同人群的18个前列腺正常组织样品，其中10个是美国的高加索白种人，8个是非裔美国人，样本来自与美国国立癌症研究中心合作的前列腺癌组织中心。采用了两种芯片结果分析方法，PAM和SAM，鉴别出在非裔人群中相比较于高加索人来说表达明显上调和下调的miRNA（(G.A.C., C.M.C., S. Volinia and S. Ambs, 数据尚未发表）。表达差异超过3倍的miRNA包括miR-301，miR-219，miR-26a，miR-1b-1和miR-30c-1。因此，对一个特定的组织，不同的人群显示出不同的microRNA表达谱。至于这种差别是不是具有家族遗传性，还需要进一步的试验说明。而研究主要是通过对遗传性高的癌症，如家族性乳腺癌或和家族性CLL等的大规模研究，确定相应的miRNA的表达谱。

结论

miRNA与癌症易感性的关系仍需进一步研究说明。但是无可否认，在多种不同类型的肿瘤发生和发展过程中，这些基因组的新成员参与了众多的信号途径的调控。

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